Emission of greenhouse gases and microbial biodiversity in soils of agricultural interest. Effect of nitrogen fertilisation

Resumen

RESUMEN En los suelos agrícolas, la aplicación de fertilizantes inorgánicos nitrogenados conduce a la interacción de múltiples factores y procesos que están asociados principalmente con cambios en las propiedades fisicoquímicas del suelo, la emisión de gases de efecto invernadero y la ecología microbiana. Aunque el nitrógeno (N) es un nutriente esencial para el crecimiento de las plantas, el aumento de la fertilización nitrogenada ha alterado el ciclo natural de N en la biosfera, lo que resulta en diversos impactos ambientales, ecológicos y sobre la salud humana. Entre ellos, el aumento de la emisión de gases de efecto invernadero, de la lluvia ácida y eutrofización. Después de la aplicación de un fertilizante nitrogenado al suelo, los procesos microbianos de nitrificación y desnitrificación son los principales responsables de las reacciones que conducen a la conversión de amonio (NH4+) y nitrato (NO3-), respectivamente, a la liberación a la atmósfera del gas de efecto invernadero óxido nitroso (N2O). Combatir los impactos negativos del aumento de los flujos de N2O plantea desafíos considerables y será ineficaz sin incorporar los procesos microbianos que intervienen en la emisión de N2O en las estrategias de mitigación. Aunque previos estudios han mostrado la existencia de relaciones individuales entre la fertilización con N y cambios en las propiedades bióticas y abióticas del suelo, un estudio integrado relacionando la forma del fertilizante N con diferencias en la emisión de N2O, cambios en las propiedades fisicoquímicas del suelo, alteraciones en la abundancia de los genes involucrados en la producción y reducción de N2O y los efectos sobre la diversidad bacteriana no se ha realizado. Para responder a estas preguntas se eligieron los fertilizantes nitrogenados urea ([CO (NH2)2] amonio (NH4)2SO4 y nitrato (KNO3) para enmendar un suelo agrícola de textura franco-arenosa de tipo Cambisol procedente de Vega de Motril (Granada, España). Tomate (Solanum lycopersicum) y judía (Phaseolus vulgaris) se utilizaron como plantas representativas de la agricultura de la zona. Los suelos, cultivados o no, se mantuvieron en condiciones de invernadero y se fertilizaron con 260 kg N ha-1. Como control se empleó suelo no fertilizado. Los suelos no cultivados se mantuvieron durante 3 años y los cultivados durante 4 cosechas consecutivas de, aproximadamente, 4 meses cada una. Durante ese tiempo, los suelos se regaron una vez a la semana para alcanzar un 80% de WFPS (Water Filled Pore Space). La concentración de los fertilizantes se determinó regularmente y cuando fue necesario, el suelo se complementó con el fertilizante correspondiente para alcanzar la tasa inicial de fertilización nitrogenada. Las variables abióticas del suelo pH, NH4+, NO3-, carbono total (TC), nitrógeno total (TN) y carbono orgánico total (TOC) se determinaron mediante muestreos puntuales durante la incubación. La producción de N2O se determinó regularmente empleando cromatografía de gases. Se tomaron muestras de suelo para determinar la abundancia total de a) bacterias (16SB) y arqueas (16SA), b) bacterias (AOB) y arqueas (AOA) oxidantes de amonio, y c) genes de la desnitrificación. La estimación de la abundancia de los genes 16S rRNA, amoA AOA, amoA AOB, napA, narG, nirK, nirS, norB, nosZI y nosZII se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa (qPCR). Las variaciones en la abundancia relativa de OTUs (Operational Taxonomic Units) se determinó mediante pirosecuenciación del gen 16S rRNA. Para analizar el efecto de la fertilización con N y la profundidad del suelo se adicionó urea, amonio y nitrato al suelo. La producción de N2O y la abundancia de genes del ciclo del N se determinaron a lo largo de la capa cultivable (20 cm) del suelo. Las variaciones en las emisiones de N2O a lo largo del perfil dependieron del tipo de fertilizante y del contenido de oxígeno disuelto detectado a cada profundidad. Las emisiones de N2O se correlacionaron con la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes en el suelo. Si bien la producción de N2O por nitrificación fue dominante en el horizonte del suelo de 0 a 10 cm, la desnitrificación fue el principal impulsor de la producción de N2O en la profundidad de 10 a 20 cm. El gen nosZ fue el más sensible al contenido de oxígeno disuelto a lo largo del perfil del suelo. Para determinar el efecto de la fertilización nitrogenada sobre a) las características fisicoquímicas del suelo, b) la emisión de N2O, c) los cambios en la abundancia de las comunidades bacterianas y arqueas, d) la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes y e) las variaciones en la diversidad bacteriana, se aplicó al suelo urea, amonio o nitrato y se cultivó, o no, con tomate y judía. El estudio incluyó tanto el suelo no rizosférico como el rizosférico de las plantas. Los flujos de emisión de N2O mostraron un pico máximo aproximadamente 2 semanas después de la fertilización con N, tanto en suelos cultivados como no cultivados. La emisión acumulada de N2O fue mayor en los suelos cultivados que en los no cultivados, y más elevada en el suelo cultivado con judía. Independientemente de la presencia o ausencia de las plantas, la emisión acumulada de N2O en el suelo tratado con urea fue mayor que el suelo con amonio y, a su vez, este mayor que el fertilizado con nitrato. Las diferencias en las emisiones de N2O se asociaron a un distinto porcentaje de los genes involucrados en la producción y reducción de N2O. Se requiere, de forma simultánea, la aplicación de un fertilizante nitrogenado y condiciones de elevada humedad para la máxima producción de N2O. Las disminuciones en la producción de N2O durante 3 años de incubación para suelos sin cultivar y 4 cosechas consecutivas para suelos cultivados se asociaron con aumentos en la abundancia del gen nosZ. La fertilización con N disminuyó la abundancia de bacterias y arqueas totales en suelos no cultivados y aumentó en los suelos cultivados. Estos resultados se asociaron al contenido de carbono del suelo. El gen amoA AOA fue más abundante que el gen amoA AOB en el suelo de la rizosfera y, por el contrario, la abundancia del amoA AOA fue menor que la del amoA AOB en el suelo no rizosférico. Los genes de la desnitrificación fueron más abundantes en el suelo no rizosférico. La fertilización con N disminuyó el número y la abundancia relativa de las OTUs bacterianas en los suelos cultivados o no con plantas de tomate y judía; este efecto fue más severo en el suelo rizosférico. La disponibilidad de N determinó principalmente los cambios en la estructura de la comunidad bacteriana en el suelo no rizosférico y fue más intenso en el suelo rizosférico. Después de la fertilización, la comunidad bacteriana fue menos diversa o dominada por un menor grupo de OTUs. En los 3 suelos fertilizados, tanto las OTU dominantes y minoritarias disminuyeron en el suelo rizosférico, mientras que solo las OTU minoritarias disminuyeron en el suelo no rizosférico. Para explorar la contribución relativa de la nitrificación y la desnitrificación en la producción de N2O después de una fertilización de 3 años con amonio o nitrato, se utilizó la técnica del marcado con 15N. En el suelo tratado con amonio, el N2O se originó a partir de la nitrificación casi por igual que de la desnitrificación mientras que la emisión del suelo tratado con nitrato derivó principalmente de la desnitrificación. La mayor abundancia del gen nosZI en el suelo tratado con nitrato fue consistente con el mayor enriquecimiento de 15N2. Para construir un modelo que explicara la importancia relativa de cada una de las variables bióticas y abióticas analizadas y la biodiversidad bacteriana como determinantes de la emisión de N2O, se realizó un análisis combinado de modelos de ecuaciones estructurales y de “bosques aleatorios” utilizando el conjunto de datos derivado de este estudio. Los resultados mostraron que las emisiones de N2O estuvieron controladas principalmente por las variables bióticas (abundancia de los genes amoA AOA. amoA AOB, napA, nirK, norB, nosZI y un conjunto de 16 OTUs bacterianas) más que por las variables abióticas (contenido de NH4+ y NO3-). Para cuantificar la importancia de la desnitrificación bacteriana y fúngica después de la aplicación de nitrato, se utilizó la aplicación individual y combinada de inhibidores del crecimiento bacteriano (estreptomicina) y fúngico (cicloheximida). Aunque las bacterias y los hongos contribuyeron casi por igual a la producción de N2O en el suelo, las bacterias dominaron sobre las de los hongos durante los primeros 2-3 días posteriores a la aplicación de nitrato. Después de ese tiempo, la situación se revirtió y la producción de N2O por hongos llegó a dominar la de las bacterias. La investigación de los efectos de la aplicación simple y combinada del inhibidor de la ureasa N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT) y del inhibidor de la nitrificación 3,4 dimetilpirazol fosfato (DMPP) sobre la volatilización de amoniaco (NH3) y la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes también se abordó en este estudio. La aplicación de NBPT redujo la volatilización de NH3 y no afectó la abundancia de bacterias y arqueas totales, ni la de los genes de la nitrificación, pero redujo la abundancia de genes de la desnitrificación al 80% de WFPS. El DMPP, solo y en combinación con NBPT, aumentó la volatilización del NH3 y la abundancia de bacterias y arqueas totales así como de la comunidad nitrificante en el suelo. Independientemente de las condiciones de humedad, DMPP y, en menor medida, DMPP + NBPT, aumentaron el número de copias los genes norB y nosZ, lo que indica que DMPP, de alguna manera, induce la expresión de, al menos, estos dos genes de la desnitrificación.