Ampliación, mejora y aplicación de plataformas metabolómicas para la determinación de vitamina d y sus metabolitos

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis La principal motivación que dio lugar a esta Memoria de Tesis fue optimizar, validar y aplicar un método para la determinación de vitamina D y sus metabolitos en sangre (suero y plasma). Los analitos a estudiar abarcaron la propia vitamina D (en las formas D2 y D3) y sus principales metabolitos mono y dihidroxilados. Se pretendió soportar el método en: (i) la completa automatización del proceso analítico (para un funcionamiento ininterrumpido y sin atención del operador durante 24 h/día, evitando o minimizando así la sobrecarga de muestras en el laboratorio), además de una adecuada validación. (ii) La multideterminación, que abarcara tantos analitos como fuera posible para obtener información cuantitativa del metabolismo de la vitamina D. (iii) El estudio en profundidad de la información básica sobre las primeras etapas del método para la cuantificación de la vitamina D y sus metabolitos y su impacto en las propiedades analíticas del mismo: la selección del tipo de muestra derivada de la sangre total (suero o plasma) y del contenedor de muestra y, especialmente, el procedimiento óptimo de preparación de la muestra. (iv) La suficiente información sobre la estabilidad de la muestra durante un periodo establecido de dos meses para evaluar el efecto de la temperatura de almacenamiento en las propiedades analíticas del método en función del/los analito/s a determinar. (v) La aplicación masiva a muestras procedentes de diferentes centros de investigación y de pacientes con diferentes enfermedades, para poner así de manifiesto las fortalezas y debilidades del método y ayudar a conocer los cambios que se producen en los metabolitos a causa de enfermedades concretas. 2. Contenido de la investigación Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se consiguieron los siguientes objetivos: (i) Automatizar y validar un método basado en el acoplamiento en línea de una estación de extracción en fase sólida (SPE) a un cromatógrafo de líquidos conectado a un espectrómetro de masas en tándem (LC–MS/MS) para la determinación en suero de vitamina D (en las formas D2 y D3) y sus principales metabolitos monohidroxilados (25-hidroxivitamina D2 [25(OH)D2] y 25-hidroxivitamina D3 [25(OH)D3]) y dihidroxilados (1,25-dihidroxivitamina D2 [1,25(OH)2D2], 1,25-dihidroxivitamina D3 [1,25(OH)2D3] y 24,25-dihidroxivitamina D3 [24,25(OH)2D3]) constituyó un objetivo específico clave. El uso de estándares internos marcados isotópicamente (SIL-ISs) y la validación externa de acuerdo con el programa de validación “vitamin D External Quality Assurance Scheme (DEQAS)” contribuyeron a dar un soporte sólido al método. (ii) Ampliar el número de metabolitos determinados fue el objetivo específico del que resultó la discriminación de los epímeros 25(OH)D3, además de mantener el resto de los hidroximetabolitos. La cromatografía de líquidos bidimensional (LC×LC) con una etapa previa de SPE y la subsiguiente detección mediante MS/MS hicieron posible la consecución de este objetivo: un método ampliado y validado mediante aplicación a muestras del programa DEQAS y a un material de referencia certificado (CRM) del NIST. (iii) Conocer la mejor muestra derivada de sangre total (suero o plasma) y el mejor procedimiento de preparación de la muestra fue el tercer objetivo específico. Se utilizaron diferentes tubos de recogida, con y sin recubrimiento interno por gel, para obtener el suero y el plasma. Por otra parte, la información necesaria sobre la etapa de preparación de la muestra se obtuvo comparando cómo afecta a cada uno de los analitos la desproteinización o la SPE previas al análisis mediante LC–MS/MS. (iv) Estudiar la estabilidad de los analitos de las muestras de suero sometidas a diferentes condiciones de conservación durante dos meses fue otro de los objetivos específicos. El estudio estadístico de los datos obtenidos en el seguimiento mediante LC–MS/MS permitió conocer la magnitud de los cambios experimentados por cada uno de los compuestos en estudio, con especial énfasis en los metabolitos. Un logro interesante de este estudio fue la comprobación de que la estabilidad de los analitos se mantiene de forma general cuando las muestras se liofilizan. (v) Validar el excelente comportamiento del método fue el último de los objetivos específicos de la Tesis, al cual el estudiante le dedicó un largo periodo de tiempo. Algunos de los ejemplos de aplicación del método por el doctorando son los siguientes: análisis de 546 muestras de suero de una cohorte de mujeres con cáncer de mama y 558 mujeres control (del proyecto MCC del Instituto de Salud Carlos III, Madrid); 1472 muestras de suero de una cohorte de mujeres pre- y postmenopáusicas (proyecto del mismo instituto); 314 muestras de suero de pacientes con esclerosis múltiple (proyecto sobre vitamina D y esclerosis múltiple en pacientes con síndromes clínicamente aislados, del Hospital San Rafaelle de Milán, Italia). Los datos analíticos han sido y están siendo en la actualidad usados con éxito por los participantes en los proyectos para la obtención de resultados que soporten o destruyan las hipótesis propuestas. Algunos de los datos obtenidos en los análisis realizados se han tratado desde el punto de vista analítico–quimiométrico. 3. Conclusión Se han desarrollado dos métodos automatizados para el análisis cuantitativo de la vitamina D y sus principales metabolitos proporcionando una rápida separación cromatográfica de las vitaminas D3 y D2 y los metabolitos 1,25(OH)2D3, 24,25(OH)2D3, 1,25(OH)2D2, 25(OH)D3, 25(OH)D2 y 3-epi-C3-25(OH)D3 en muestras de suero (a nivel de nmol/L o pmol/L). Ambas plataformas se han caracterizado y validado mediante programas externos utilizando muestras proporcionadas por DEQAS, para la determinación del total de 25(OH)D y 1,25(OH)2D, y un material de referencia certificado por el NIST para validar la determinación individual de los epímeros del 25(OH)D3. Se han establecido unas recomendaciones en lo que se refiere a la conservación de la muestra (referidas tanto al tiempo de almacenamiento como a los ciclos de congelación/descongelación) deben mantenerse para la medición de todos los metabolitos de la vitamina D3 en estudios clínicos, donde la sensibilidad es un parámetro crítico. Por otro lado, la liofilización y posterior almacenamiento a temperatura ambiente son una estrategia fácil, rápida y robusta para conservar las muestras que se utilizarán en los estudios clínicos. Finalmente, tres centros de investigación nacionales e internacionales han solicitado el análisis de la vitamina D y sus metabolitos en 2890 muestras de suero para determinar el metabolismo de la vitamina D en diferentes estudios clínicos realizados a lo largo del desarrollo de la Tesis.