Sigma-1 receptor inhibition ameliorates neuropathic pain induced by nerve transection

Resumen

La Asociación Internacional para el estudio del dolor (IASP, por sus siglas en inglés) define el dolor neuropático como un dolor causado por una lesión o enfermedad del sistema nervioso somatosensorial. El dolor neuropático tiene una etiología muy diversa incluyendo la neuropatía periférica producida por un daño nervioso. Afecta al 8% de la población y se espera que esta prevalencia aumente en el futuro (Colloca et al., 2017). A pesar de los enormes esfuerzos tanto a nivel preclínico como clínico, los tratamientos farmacológicos disponibles hasta la fecha para paliar el dolor neuropático tienen una eficacia muy limitada, por lo que resulta de vital importancia la búsqueda de nuevas herramientas farmacológicas para su adecuado tratamiento (Colloca et al., 2017). El receptor sigma-1 es una proteína chaperona regulada por ligando que bajo situaciones de estrés celular migra desde el retículo endoplásmico a la membrana plasmática, modulando la actividad de varios canales iónicos y receptores acoplados a proteínas G con los que interacciona físicamente. El receptor sigma-1 es una diana muy prometedora para el tratamiento del dolor neuropático, dónde ha sido ampliamente estudiado a nivel preclínico (Sánchez-Fernández et al., 2017). Entre los antagonistas selectivos sigma-1, el que ha sido caracterizado en mayor profundidad es el S1RA (Vela et al., 2015). Este fármaco ha sido evaluado en ensayos clínicos de fase II en pacientes con dolor neuropático inducido por quimioterapia, con resultados prometedores (Bruna et al., 2018). Aunque ya ha sido descrito el papel de la inhibición del receptor sigma-1 en modelos preclínicos de dolor neuropático inducidos por ligadura o constricción de nervios periféricos (Romero et al., 2012; Espinosa-Juárez et al., 2017), se desconoce su papel en la neuropatía producida por la sección de un nervio periférico. Realizar este estudio es interesante pues durante las intervenciones quirúrgicas (como toracotomía o mastectomía) la sección de nervios resulta inevitable, y como consecuencia, un gran número de pacientes desarrollan dolor neuropático postquirúrgico (Borsook et al., 2013). Además, los patrones de las alteraciones sensoriales así como los cambios de expresión génicos y neuroplásticos difieren entre los modelos de ligadura/constricción de nervio y los de denervación (Casals-Diaz et al. 2009), lo que podría implicar que la respuesta farmacológica fuese diferente también. Por ello, en esta Tesis hemos evaluado el papel del receptor sigma-1 en la neuropatía que se produce en el modelo de lesión de nervio compartido (SNI, por sus siglas en inglés Spared Nerve Injury). El SNI consiste en seccionar dos de las tres ramas del nervio ciático dejando la rama sural intacta (Decosterd y Woolf, 2000). Por otra parte, se sabe que el receptor sigma-1 modula la analgesia opioide endógena periférica producida por ciertas células inmunitarias en el foco inflamatorio, contribuyendo a controlar el dolor (Tejada et al., 2018). Sin embargo, se desconoce por completo si los receptores sigma-1 también modulan esta analgesia opioide endógena durante el dolor neuropático. Los mecanismos implicados en el alivio del dolor neuropático producidos por el bloqueo del receptor sigma-1 han sido estudiados mayoritariamente a nivel del sistema nervioso central, donde este receptor modula la sensibilización central (Sánchez-Fernández et al., 2017), disminuye la liberación de citoquinas proinflamatorias (Zhu et al., 2015) y reduce la activación astrocitaria y microglial (Zhu et al., 2015). Sin embargo, se desconoce la contribución del receptor sigma-1 en el dolor neuropático a nivel periférico, a pesar de que el receptor sigma-1 se expresa mayoritariamente en las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG, de sus siglas en inglés dorsal root ganglia) (Sánchez-Fernández et al., 2017). La sección de un nervio periférico produce cambios en el sitio de la lesión así como en los somas de las neuronas axotomizadas. Por ejemplo, las neuronas lesionadas sufren un proceso de cromatolisis desplazando su núcleo desde una posición central hasta la periferia; así mismo estas neuronas comienzan a expresar factores de transcripción como el ATF3 (Chandran et al., 2016; Johnson and Sears, 2013) (de sus siglas en inglés activating transcription factor 3). Entre estos cambios, la infiltración de macrófagos, atraídos por la citoquina CCL2, parece que juega un papel clave en el desarrollo del dolor neuropático (Zigmond and Echevarria, 2019). La posible participación del receptor sigma-1 en este proceso neuroinflamatorio a nivel periférico se desconoce hasta la fecha. Teniendo en cuenta todos estos antecedentes, en esta tesis doctoral nos centramos en el estudio del efecto de la inhibición del receptor sigma-1 sobre la hipersensibilidad dolorosa producida por el modelo SNI, así como de la contribución de la analgesia opioide endógena a este efecto del receptor sigma-1. Además, también estudiamos la contribución del receptor sigma-1 a la infiltración de macrófagos dentro del DRG que se produce durante el SNI. Inicialmente estudiamos el desarrollo de la alodinia al frio (mediante el test de la acetona), la alodinia mecánica (con el test de von Frey manual) y la hiperalgesia al calor (mediante el test de Hargreaves) en la neuropatía producida tras el SNI en ratones hembra tipo salvaje (WT, de sus siglas en inglés wild-type) y mutante desprovistos del receptor sigma-1 (Sig-1R-KO, de sus siglas en inglés knockout). El SNI produjo la misma hiperalgesia al calor en ratones WT y Sig-1R-KO. Sin embargo, la alodinia mecánica fue menor en ratones Sig-1R-KO que en ratones WT, y los ratones Sig-1R-KO no desarrollaron alodinia al frio. Después estudiamos el efecto de la inhibición farmacológica del receptor sigma-1 y para ello administramos el antagonista selectivo S1RA (8-128 mg/kg, s.c.). El S1RA inhibió las distintas alteraciones sensoriales producidas por el SNI en los ratones WT de manera dosis dependiente. De las tres modalidades sensoriales exploradas, la alodinia al frio fue la más sensible al efecto del S1RA, ya que fue revertida completamente con la dosis de 16 mg/kg, mientras que la dosis de 64 mg/kg fue necesaria para revertir la hiperalgesia al calor y la de 128 mg/kg para revertir parcialmente la alodinia mecánica. Los efectos antinociceptivos del S1RA fueron revertidos por completo por el agonista selectivo del receptor sigma-1 PRE-084 (32 mg/kg, s.c.), y estuvieron totalmente ausentes en los ratones Sig-1R-KO (64-128 mg/kg, s.c.), demostrando así la selectividad del S1RA por los receptores sigma-1. Por lo tanto, el receptor sigma-1 juega un papel importante en el dolor neuropático inducido por la sección del nervio ciático en ratón. Para comprobar la contribución del sistema opioide endógeno al efecto antineuropático producido por el antagonismo sigma-1 tras la sección del nervio ciático, inyectamos naloxona o su derivado de acción periférica naloxona metiodida, previamente al S1RA. La administración de naloxona (1 mg/kg, s.c.) o naloxona-metiodida (2 mg/kg, s.c.), revirtió completamente el efecto del S1RA (16-128 mg/kg, s.c.) en la hiperalgesia al calor y la alodinia mecánica, pero no en la alodinia al frio, indicando que los efectos producidos por el antagonismo del receptor sigma-1 están mediados por mecanismos dependientes de opioides (en alodinia mecánica e hiperalgesia al calor) y no dependientes de opioides (en alodinia al frio). La administración de morfina (0.5-2 mg/kg, s.c.) revirtió completamente la hipersensibilidad al calor y al frio y parcialmente la alodinia mecánica. La administración de naloxona revirtió el efecto de la morfina en las tres modalidades sensoriales exploradas, mientras que la naloxona-metiodida solo consiguió revertir la inhibición por morfina de la hiperalgesia al calor y la alodinia mecánica. A continuación estudiamos el efecto del tratamiento repetido con una antagonista sigma-1 en la neuropatía producida tras el SNI. El tratamiento continuado con S1RA (25 mg/kg, i.p., 2 veces al día durante 10 días), redujo la hipersensibilidad mecánica, al frio y al calor producida por el SNI sin inducir tolerancia al efecto analgésico. Estos efectos antinociceptivos fueron observados hasta 12 horas después de la última administración del fármaco, cuando el S1RA a nivel plasmático y cerebral fue indetectable mediante HPLC-MS/MS; indicando, por tanto, que están mediados por un efecto farmacodinámico prolongado en el tiempo. En cambio, cuando se administró de forma aguda la misma dosis de S1RA (25 mg/kg, i.p.) solo fue capaz de revertir la alodinia al frio, debido a la mayor potencia que presenta el S1RA sobre esta manifestación comportamental, y el efecto fue de muy corta duración, habiendo desaparecido a los 90 min de su administración. Además, también nos propusimos estudiar el mecanismo por el cual el receptor sigma-1 paliaba la hipersensibilidad dolorosa producida por el SNI a nivel periférico. Para ello, a los 7 días del SNI se extrajeron los DRGs donde están localizados mayoritariamente los cuerpos de las neuronas que reciben las aferencias del nervio ciático de animales WT y Sig-1R-KO y se realizó un estudio inmunohistoquímico con anticuerpos específicos para neuronas (NeuN), estrés celular (ATF3), macrófagos (Iba-1) y para el propio receptor sigma-1. Asimismo, se realizaron experimentos mediante citometría de flujo (FACs, de sus siglas en inglés Fluorescence-Activated Cell Sorting) con el marcador para macrófagos (CD11b). En los estudios inmunohistoquímicos encontramos que las neuronas lesionadas mostraron su núcleo de forma excéntrica, una reducción a la baja en el marcaje de NeuN, así como un cambio en el patrón de distribución celular del receptor sigma-1, que pasó de un marcaje celular homogéneo (excluido el núcleo celular), a una concentración del marcaje en la periferia del soma neuronal y alrededor del núcleo celular. Además, el 78% de las neuronas que externalizaban el receptor sigma-1 expresaban ATF3; es decir las neuronas lesionadas externalizaron el receptor sigma-1. Para estudiar si el receptor sigma-1 tiene alguna relevancia en la infiltración de los macrófagos en el DRG tras el SNI, realizamos un ensayo de inmunohistoquímica con los anticuerpos dirigidos contra el receptor sigma-1 y contra los macrófagos. El número de neuronas que estaban rodeadas de macrófagos fue mayor en las neuronas con el receptor sigma-1 translocado (69.5%) que en aquellas donde el receptor sigma-1 se encontraba homogéneamente distribuido por el citoplasma (30.5%). Cabe destacar que estos macrófagos adoptaron una distribución alrededor de las neuronas dañadas formando estructuras en forma de anillo. Para aclarar el papel del receptor sigma-1 en la infiltración de macrófagos después del SNI, realizamos un ensayo de inmunohistoquímica en animales Sig-1R-KO. Se observó que el incremento del número de macrófagos era significativamente menor en animales mutantes desprovistos del receptor sigma-1 que en animales salvajes. Estos resultados se confirmaron mediante FACs, ya que comprobamos que el SNI produjo una infiltración masiva de macrófagos en los DRG de ratones WT, mientras que este reclutamiento fue mucho menor en animales Sig-1R-KO. Estos resultados podrían indicar que existe una posible interacción neurona-macrófago y que el receptor sigma-1 puede estar participando en el reclutamiento de estas células inmunitarias. Por último, se sabe que tras una lesión de un nervio periférico las neuronas del DRG liberan la quimioquina CCL2 (también denominada MCP-1) que tiene un papel relevante en el reclutamiento de macrófagos hasta el DRG. Por tanto, nos propusimos estudiar el papel del receptor sigma-1 en la liberación de la quimioquina CCL2 en el DRG. Para ello, mediante ELISA, realizamos una determinación de los niveles de CCL2 después del SNI en ratones WT y Sig-1R-KO. Los DRGs de los animales Sig-1R-KO mostraron niveles más bajos de esta quimioquina en todos los puntos temporales estudiados (6 horas, 24 horas, 3 días y 7 días, tras el SNI) pero especialmente a día 3, que es donde se encontró el pico máximo de concentración de CCL2 en los animales WT. Estos resultados sugieren que el receptor sigma-1 podría modular la liberación de la quimioquina CCL2 en el DRG después del SNI y que esto podría contribuir a la menor infiltración de macrófagos encontrada en los animales Sig-1R-KO tras el SNI y la consiguiente reducción de la hipersensibilidad dolorosa que mostraron los animales desprovistos del receptor sigma-1. En conclusión, el receptor sigma-1 juega un papel relevante en la fisiopatología de la neuropatía inducida por sección del nervio ciático, reduciendo el proceso neuroinflamatorio dependiente de macrófagos que acontece durante dicha neuropatía en los DRGs e inhibiendo las manifestaciones dolorosas de la neuropatía, mediante mecanismos dependientes e independientes de opioides endógenos. Estos datos sugieren que el antagonismo del receptor sigma-1 podría ser una herramienta terapéutica potencial para prevenir o tratar el dolor neuropático inducido por sección de nervios periféricos. 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