Chem-mdbpdevelopment of chemistry-based multiplexing diagnostic beadplatforms

Resumen

La biotecnología y la nanotecnología se encuentran en su máximo esplendor a tenor de las excelentes publicaciones científicas que atesoran, las importantes inversions de capital y los desarrollos tecnológicos derivados que están constantement revolucionando la ciencia y la sociedad. El desarrollo y la utilización de los llamados materiales “smart” así como los nanomateriales, han supuesto un antes y un después en la ciencia. Las tecnologías novedosas surgidas en consencia generan un impacto incalculable tanto a nivel económico como en el conocimiento. En este contexto, esta tesis doctoral tiene como objetico el utilizar estos materiales “smart” y las tecnologías recientes para crear una plataforma enfocada en el diagnóstico y basada en partículas. Esta plataforma permite realizar tanto ensayos moleculares como ensayos celulares mediante la aplicación de la química. Para ello, se ha desarrollado una plataforma basada en partículas de poliestireno que combina ácidos nucleicos, metales y diferentes plataformas analíticas. En cuanto a los ensayos moleculares, la plataforma de detección combina partículas magnéticas de poliestireno y la tecnología Chem-NAT, que es una tecnología libre de PCR y basada en química para la detección de ácidos nucléicos con resolución de una única base. Para ello se emplean ácidos nucleicos peptídicos con una posición libre de base (DGL) y cuyas secuencias son totalmente complementarias a las sequencias de los ácidos nucleicos de interés. Esto se debe a que los ácidos nucleicos actúan como un molde de una reacción de incorporación dinámica específica, y controllada termodinámicante, de una nucleobase modificada con un grupo aldehído (Smart-NB) en la posición donde no hay nucleobase. En esta reacción se produce a través de la formación de un enlace covalente reversible, una iminio, que es posteriormente reducido a un enlace covalente irreversible, formando una amina terciaria. Debido al control termodinámico ejercido por el ácido nucleico de interés, esta tecnología es altamente selectiva y específica, evitando la presencia de fasos positivos. Esta tecnología Chem-NAT ha sido usada tanto para aplicaciones cuantitativas como cualitativas: (i) Aplicaciones cuantitativas: Se presenta la síntesis y optimización de sondas DGL para la detección directa y cuantificación de miR-21 mdiante el uso plataformas basadas en fluorescencia, y a través de conjugación por química dinámica (DCL). La optimización de las sondas DGL se ha llevado a cabo por citometría de flujo, mientras que para la detección directa y cuantificación se ha utilizado un lector de placas basado en fluorescencia. MiR-21 has sido detectado y cuantificado con éxito a partir de células tumorales y de plasma de pacientes con cáncer de pulmón (NSCLC) en estadíos avanzados. Además, también se ha evaluado la capacidad de la plataforma diagnóstica para realizar ensayos de “multiplexing” mediante la detección específica de miR-21 y miR-122 en la misma muestra. (ii) Aplicaciones cualitativas: Se presenta la capacidad dela plataforma diagnóstica para detectar mutaciones de una única base en KRAS. La secuencia KRAS silvestre y la secuencia mutrada G13C KRAS han sido identificadas con éxito en la misma muestra mediante citometría de flujo. Por otro lado, la plataforma de diagnóstico basada en partículas para ensayos celulares también ha sido presentada en esta tesis doctoral. Nanopartículas reticuladas y amino-functionalizadas de poliestireno fueron conjugadas con fluoróforos y metales, dando lugar a nanopartículas metalofluorescentes para aplicaciones multimodales en diagnóstico. La combinación dual de fluoróforo y metal permitió que las nanopartículas se utilizaran como sondas para técnicas de imagen y citometria, para catalizar reacciones químicas y como reactivos para técnicas basadas en masas. Además, las propiedas intrínsecas de los fluoróforos, como el tiempo de vida meda de fluorescencia, permitó su utilización como sondas para microscopía de tiempo de vida media de fluorescencia. Además, debido a la presencia de metales, especialmente paladio, las nanopartículas metalofluorescentes adquirieron unas interesantes características adicionales sin afectar a la fluorescencia. Por ejemplo, las nanopartículas metalofluorescente con paladio pueden actuar como catalizadores de reacions químicas. Finalmente, debido a su naturaleza dual, las nanopartículas metalofluorescenes pudieron ser empleadas como reactivos en citometría de masas y citometría de flujo. A través de la combinación de isótopos puros de paladio, las nanopartículas metalofluoresccnetes fueron empleadas como reactivos para codificación celular en citometría de amsas. En esta tesis doctoral, por tanto, se presenta la primera prueba de concepto de codificación celular con dos nanopartículas metalofluorescentes, así como l primer ensayo para codificación de células vivas. En esta prueba de concepto se demuestra la alta capacidad, la inocuidad, la especificidad y la resistencia de las nanopartículas metalofluorescentes para su utilización como reactivos de codificacón de células vivas para citometría de masas y citometría de flujo.