Estrategias analíticas para la mejora de la determinación cualitativa y cuantitativa en metabolómica mediante espectrometría de masas

Resumen

1. Introducción o motivación de la Tesis El objetivo primordial de la metabolómica consiste en analizar el conjunto de compuestos de bajo peso molecular presentes en un fluido biológico, célula, tejido u organismo, en unas condiciones fisiológicas específicas o en respuesta a diferentes perturbaciones o estímulos. Las principales limitaciones del análisis metabolómico están relacionadas con la identificación de los metabolitos, ya que las bases de datos existentes no están tan actualizadas como las del resto de disciplinas ómicas. Por otro lado, no existen protocolos universales para abordar el análisis metabolómico de determinadas muestras, ya que aún quedan aspectos por estandarizar. Entre ellos cabe destacar la obtención de información que permita la identificación inequívoca de metabolitos, ya que incluso para la espectrometría de masas, la técnica de mayor poder de detección, no hay un protocolo que garantice un buen nivel de identificación de compuestos sin una formación exhaustiva del personal implicado en los análisis. Otro aspecto poco establecido es la aplicación de protocolos de validación que aseguren la calidad analítica de los resultados generados. Casi todas las limitaciones de la metabolómica son consecuencia de la gran complejidad de las muestras biológicas, que incluyen una amplia variedad de metabolitos de diversa naturaleza química y que cubren un rango de concentraciones de varios órdenes de magnitud. Por este motivo, es técnicamente inviable el desarrollo de un método analítico que en un único análisis proporcione resultados de metabolitos como, por ejemplo, la glucosa, de tipo polar presente a concentración milimolar, y el calcitriol, metabolito no polar presente a nivel picomolar. En este sentido la presencia de compuestos mayoritarios complica la detección de los metabolitos presentes a baja concentración. Resulta evidente que existe una demanda de metodologías más sensibles, selectivas y precisas, que proporcionen mayor capacidad de detección de metabolitos (medida por lo que se denomina cobertura metabolómica del término inglés “metabolomics coverage”). Con estas premisas, se puede decir que el mayor reto actual de la metabolómica es maximizar la capacidad de detección de los métodos analíticos con el fin de conseguir la identificación inequívoca de los miles de metabolitos existentes en un organismo. Este reto es actualmente utópico cuando se trabaja con organismos complejos pues no existe una única metodología que permita alcanzar el nivel de detección de algunos metabolitos en organismos superiores. Por ello, la principal motivación de la Tesis Doctoral fue buscar soluciones para los distintos retos a los que se enfrenta actualmente la metabolómica. 2. Contenido de la investigación El objetivo básico de la investigación en esta Tesis fue desarrollar nuevas estrategias analíticas basadas en el uso de espectrometría de masas de baja y alta resolución para mejorar la detección y la cobertura de identificación. Este objetivo se dividió en tres objetivos generales de acuerdo con los diferentes temas de esta investigación: (i) aprovechar la versatilidad del analizador de triple cuadrupolo (QqQ) para mejorar la identificación/cuantificación de ciertas familias de metabolitos; (b) desarrollar nuevas herramientas para mejorar la detección e identificación de metabolitos mediante técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas de alta resolución; y (c) crear estrategias para buscar biomarcadores potenciales en estudios clínicos y agroalimentarios. En este contexto, la Tesis ha dado lugar a los siguientes resultados: - Desarrollo de un método cualitativo y cuantitativo automatizado basado en el acoplamiento en línea de la extracción en fase sólida (SPE) y la cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas en tándem (LC–MS/MS) para maximizar la sensibilidad en la determinación de ésteres de ácidos grasos y ácidos grasos hidroxilados (FAHFAs) en suero. El método se aplicó a una cohorte de individuos para evaluar la influencia de la glicemia en los niveles de FAHFAs [1]. - Propuesta de una estrategia cualitativa/cuantitativa para la determinación de lípidos polares en plasma humano por LC–MS/MS. Se combinaron dos métodos de adquisición de datos MS/MS para identificar y confirmar la presencia de lípidos polares en plasma. La propuesta se llevó a cabo en dos pasos: a) identificación de lípidos a través del patrón de fragmentación característico para cada familia; y b) confirmación de los lípidos detectados mediante la monitorización de iones producto correspondientes a los ácidos grasos (FAs) que los conforman u otros iones característicos. - Estudio sobre las diferencias a nivel de metabolitos entre suero y plasma obtenidos con tubos convencionales (tubo de heparina para plasma) y tubos con gel polimérico mediante la aplicación de un enfoque no dirigido basado en cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo (GC–TOF/MS). Se seleccionó una cohorte de voluntarios para el muestreo de sangre utilizando cuatro tipos de tubos (plasma, plasma-gel, suero y suero-gel) [2]. - Evaluación de la influencia de la preparación de la muestra en la determinación de lípidos polares en tejido adiposo visceral. Se probaron dos disolventes para comparar su eficiencia en la extracción de lípidos polares, pero también su ineficiencia para la extracción de acilglicéridos (las principales interferencias en la detección de lípidos polares). Además, se evaluó la implementación de una etapa SPE con un sorbente selectivo para la retención de glicerofosfolípidos con el fin de verificar su influencia en la detección posterior de esta familia de lípidos [3]. - Desarrollo de una estrategia para maximizar la cobertura de metabolitos identificados en muestras fecales de cerdo a través del estudio de la preparación de la muestra. Con este propósito se combinaron dos técnicas de detección, LC–QTOF MS/MS y GC–TOF/MS, para evaluar su complementariedad en términos de identificación. Con respecto a la preparación de la muestra, se probaron seis disolventes con diferente polaridad para evaluar su rendimiento de extracción y, en el caso de GC–MS, se compararon dos protocolos de derivatización [4]. - Diseño y desarrollo de un nuevo paquete estadístico, llamado MetaboQC, para estudiar y filtrar la variabilidad instrumental en conjuntos de datos generados mediante análisis por espectrometría de masas en secuencias desarrolladas durante varios días. Esta nueva herramienta utiliza controles de calidad (QCs) para corregir individualmente cualquier tendencia en las señales cuantitativas de metabolitos que puedan estar asociadas a la variabilidad instrumental [5]. - Estudio, mediante un análisis metabolómico no dirigido, de la respuesta posprandial a la prueba oral de tolerancia a la grasa (OFTT) en el perfil metabólico plasmático. Las muestras de plasma recolectadas se analizaron por LC–QTOF MS/MS y GC–TOF/MS. Los resultados de este estudio abren una vía al uso de este test para el diagnóstico de un amplio abanico de patologías. - Evaluación de la capacidad predictiva de la aparición de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) mediante el examen de la respuesta posprandial (después de la OFTT). En este estudio se recogieron muestras de plasma de 215 pacientes (proyecto CORDIOPREV) justo antes y cuatro horas después de la prueba OFTT. 107 personas desarrollaron diabetes después de cinco años. Las muestras de plasma se analizaron por LC–QTOF MS/MS y GC–TOF/MS. - Dilucidación de los eventos que preceden al inicio de la autoinmunidad de los islotes y la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM). Se utilizó la metabolómica para determinar los niveles de lípidos moleculares y metabolitos polares en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aisladas de muestras prospectivas recolectadas en el estudio de Predicción y Prevención de Diabetes Tipo 1 (DIPP) [6]. - Desarrollo de modelos de discriminación y búsqueda de paneles de marcadores con capacidad para la clasificación de cerdos por su régimen de alimentación. Se utilizaron 80 muestras de tejido adiposo subcutáneo de cerdos ibéricos sometidos a cuatro regímenes de alimentación. Los datos se obtuvieron combinando el método clásico para la determinación de FAs basado en GC–FID y un método para la determinación de las abundancias isotópicas de carbono por espectrometría de masas con relación isotópica (IRMS) [7]. 3. Conclusiones Las conclusiones más destacadas de la Tesis Doctoral de acuerdo con los objetivos inicialmente propuestos son los siguientes: 1. Beneficios de utilizar la versatilidad del analizador de triple cuadrupolo para mejorar la identificación/cuantificación de ciertas familias de metabolitos. i) Se ha desarrollado un método automatizado basado en SPE en línea acoplada a LC–MS/MS para la determinación de FAHFAs en suero. El método permitió identificar y cuantificar en términos relativos 11 FAHFAs en suero mediante el desarrollo de una estrategia de análisis confirmatorio. Los FAHFAs más concentrados en suero fueron PAHSA y PAHOA. Se han detectado diferencias significativas en los niveles de PAHPA y POHPO en función del estado glucémico, y de POHPA en función del BMI [1]. ii) Se ha optimizado una estrategia de análisis para la identificación y cuantificación masiva de lípidos polares por LC–MS/MS con un analizador QqQ. La combinación de dos métodos MRM permitió monitorizar 398 lípidos polares en 64 minutos (32 minutos por cada método) después de la aplicación de un protocolo de preparación de muestra simple. La estrategia propuesta puede usarse en el análisis lipidómico de muestras biológicas para obtener información cualitativa y semicuantitativa de familias de lípidos polares. 2. Mejora del proceso analítico (muestreo, preparación de muestra y análisis de datos) a través del desarrollo metodológico en análisis metabolómico no dirigido. Muestreo (iii) Es esencial tener en cuenta las alteraciones que se producen en los protocolos experimentales de análisis metabolómico cuando se toman muestras de sangre. Se ha comparado suero y plasma recogidos en tubos con gel polimérico con suero y plasma obtenidos en tubos convencionales utilizando un enfoque no orientado mediante GC–TOF/MS. Se detectaron cambios significativos atribuibles al gel polimérico en suero, mientras que no se observaron diferencias en el plasma, que proporcionó un perfil de metabolitos similar al del plasma recogido en tubos convencionales. Adicionalmente, se han evaluado las diferencias de metabolitos entre suero y plasma recolectado en tubos convencionales del mismo grupo de individuos. Estas diferencias afectaron a rutas importantes como el ciclo del ácido cítrico, el metabolismo de los aminoácidos, de la fructosa y la manosa y de los glicerolípidos, así como las interconversiones pentosa/glucuronato [2]. Preparación de la muestra (iv) Se ha estudiado la influencia de la preparación de la muestra en el análisis lipidómico de lípidos polares en tejido adiposo. Según los resultados obtenidos, se recomienda la LLE seguida de una etapa SPE para mejorar la detección de glicerofosfolípidos. Respecto al extractante, el MTBE favoreció la detección de lípidos menos abundantes como ceramidas y ácidos grasos insaturados y, por lo tanto, se recomienda para el análisis no dirigido de lípidos polares [3]. (v) Se ha evaluado la influencia de la preparación de la muestra en la capacidad de detección de metabolitos en el análisis de muestras de heces de cerdo mediante LC–MS/MS y GC–MS. Se han identificado tentativamente un total de 303 compuestos mediante combinación de todos los extractantes y plataformas analíticas estudiadas. Según los resultados obtenidos, se recomienda la utilización de MeOH/agua como extractante para el análisis GC–MS. Sin embargo, para LC–MS/MS el análisis combinado de extractos obtenidos con MeOH o MeOH/agua y acetato de etilo puede dar lugar a un aumento significativo de los compuestos identificados. Respecto a la etapa de derivatización por sililación, la implementación de una metoximación previa hizo posible la identificación de tres α-cetoácidos que no se detectan con las otras estrategias. Con respecto a la complementariedad de las dos plataformas analíticas, es obvio que ambas deben combinarse para obtener una visión integral del metaboloma de las heces de cerdo [4]. Análisis de datos (vi) Se ha desarrollado una herramienta para la corrección de la variabilidad experimental asociada a la respuesta cuantitativa instrumental y su implementación en flujos de trabajo de metabolómica basados en la detección por MS. El paquete propuesto se basa en funciones que pueden usarse para corregir la variabilidad en los datos obtenidos en estudios de metabolómica con un gran conjunto de muestras. La estrategia incluida en este paquete implica que cada metabolito se corrige de acuerdo con la función que mejor se adapte a su tendencia de variabilidad. Por lo tanto, la corrección se aplica independientemente a cada metabolito [5]. 3. Desarrollo de estrategias para la búsqueda de biomarcadores potenciales en aplicaciones clínicas y agroalimentarias. Aplicaciones clínicas (vii) Se han estudiado las alteraciones metabólicas producidas en el postprandio del OFTT, mediante la combinación de LC–QTOF MS/MS y GC–QTOF/MS. Las alteraciones metabólicas más importantes afectaron a los procesos inflamatorios y oxidativos, la síntesis de ácidos biliares primarios y secundarios, síntesis de carnitinas y a la producción de cortisol. Este estudio reveló que el OFTT se puede utilizar para interpretar las desviaciones asociadas a enfermedades metabólicas, aumentando la utilidad del OFTT. (viii) Se ha evaluado la capacidad predictiva de los cambios metabólicos que ocurren en el postprandio del OFTT para predecir el desarrollo de T2DM. Teniendo en cuenta la complejidad de la patogénesis de T2DM, se configuraron dos paneles multimetabolitos para identificar futuros pacientes con T2DM. La combinación de los dos paneles condujo a un modelo con una sensibilidad del 86,6% y una especificidad del 71,6%. El HR obtenido para ambos paneles, 5.4 (3.0-9.6) y 6.5 (3.7-11.4), reveló su poder predictivo y el hecho de que reflejan alteraciones metabólicas asociadas a la oxidación, la secreción de insulina y la actividad mitocondrial y de los peroxisomas. (ix) Se han estudiado los patrones metabólicos que se producen en las BMPC de niños que han desarrollado autoinmunidad en las células β pancreáticas o T1DM. El análisis de rutas metabólicas sugirió que el metabolismo de alanina, aspartato, glutamato, glicerofosfolípidos y esfingolípidos estaba sobreexpresado en PT1D. Se han desarrollado modelos metabólicos a escala del genoma de las CMSP en la progresión de la T1DM utilizando los datos transcriptómicos disponibles y los resultados del análisis metabolómico. Los modelos desarrollados mostraron alteraciones en la ruta metabólica de las ceramidas, asociadas específicamente con la progresión de la T1DM [6]. Aplicaciones agroalimentarias (x) La combinación estadística de los resultados obtenidos por diferentes métodos analíticos (concretamente la determinación de ácidos grasos por GC–FID y de δ13C por análisis IRMS) podría ser la clave para la correcta discriminación de los regímenes alimenticios en el sector del cerdo ibérico. Teniendo en cuenta la demanda de métodos para discriminar los regímenes de alimentación, este enfoque podría implementarse en laboratorios de rutina, ya que el análisis de ácidos grasos se ha realizado tradicionalmente con este fin mediante GC–FID, mientras que el análisis IRMS se usa con frecuencia en laboratorios alimentarios de referencia, por lo que los resultados de ambos conlleva una mayor seguridad en el diagnóstico [7]. 4. Bibliografía 1. M.A. López-Bascón, M. Calderón-Santiago, F. Priego-Capote. 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