Caracterización de nanosistemas magnéticos y su aplicación en quimioterapia dirigida y nanorremediación

Resumen

Las nanopartículas de magnetita (Fe3O4) han despertado un gran interés en el campo de la biotecnología debido a su alta relación superficie/volumen, que puede utilizarse para anclar cantidades relativamente altas de moléculas específicas, y porque pueden manipularse fácilmente utilizando un campo magnético externo, debido a su alto momento magnético en comparación con otros óxidos de hierro. Se pueden sintetizar de manera inorgánica utilizando diferentes procesos pero, generalmente, a altas temperaturas y presiones, lo que implica altos costes de producción. Además, estas magnetitas producidas químicamente no suelen presentar todas las características deseables (alta magnetización, tamaños y morfologías adecuadas, biocompatibilidad o alta estabilidad química) para ciertas aplicaciones biomédicas. Las bacterias magnetotácticas (MTB) sintetizan magnetosomas, compuestos de Fe3O4 monocristalino envuelto por una membrana, mediante un estricto control genético en el que intervienen proteínas únicas llamadas proteínas asociadas a magnetosomas (MAPs). Este proceso de biomineralización controlada (BCM) da como resultado nanopartículas de magnetita con estructuras cristalinas perfectas, alta pureza química, morfologías alargadas y una estrecha distribución de tamaños entre 30 y 120 nm, que hace que estos cristales sean de dominio magnético único y, en consecuencia, la nanopartícula magnética ideal. Sin embargo, no es posible escalar a nivel industrial el cultivo de MTB debido a sus exigentes condiciones nutricionales y su lento crecimiento, por lo que los magnetosomas no pueden obtenerse en grandes cantidades. De hecho, este es el cuello de botella para la aplicación de los magnetosomas en nanotecnología. En este contexto, una de las alternativas propuestas es la biomimética, es decir, la producción in vitro de nanopartículas magnéticas similares a los magnetosomas mediante la utilización de MAPs, dado que la interacción preferencial de MAPs con el cristal de magnetita se ha sugerido para explicar las propiedades únicas de las magnetitas producidas por las MTB. Sin embargo, todavía hay muchas incógnitas relacionadas con las estructuras y funciones de la mayoría de las MAPs. Por lo tanto, desde un punto de vista biológico, así como para la aplicación práctica de estas nanopartículas de magnetita biomiméticas (BMNPs), comprender este proceso de BCM, el único conocido hasta ahora en el dominio Bacteria, representa un desafío de extraordinaria importancia. En este sentido, en el Capítulo I de esta Tesis Doctoral, se estudian por primera vez las funciones combinadas de dos MAPs diferentes, MamC y Mms6 de Magnetococcus marinus MC-1, para sintetizar magnetitas biomiméticas. Nuestros resultados muestran que MamC y Mms6 tienen funciones diferentes, pero complementarias, en la nucleación y el crecimiento de magnetita in vitro. MamC parece controlar la cinética de la nucleación de los cristales, combinando efectos ionotrópicos y molde, mientras que Mms6 parece controlar preferiblemente la cinética del crecimiento de los cristales al actuar como reservorio de Fe. El efecto combinado de estas MAPs produce cristales bien facetados, de gran tamaño (30 ± 10 nm) y con mejores propiedades magnéticas que las nanopartículas inorgánicas o producidas en presencia de sólo una de estas dos proteínas, indicado por una mayor temperatura de bloqueo y, por tanto, un mayor momento magnético por partícula. Por tanto, estas nuevas BMNPs con propiedades magnéticas mejoradas podrían ser potencialmente útiles en aplicaciones nanotecnológicas. Los capítulos II a V se centran en la evaluación in vitro (II, III, IV) e in vivo (V) de las BMNPs, producidas en presencia de MamC, como potenciales nanoportadores para terapias antitumorales, ya que esta MAP había sido previamente purificada y ampliamente estudiada por nuestro grupo. El capítulo II incluye la caracterización fisicoquímica de estas BMNPS y su funcionalización con el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina (DOXO). Estas BMNPs se caracterizaron como nanopartículas superparamagnéticas (a 300 K) de 30-40 nm, compuestas por ~95% en peso de magnetita y ~5% en peso de MamC, con un área superficial específica de 90 m2/g. Además, los grupos funcionales de MamC expuestos en la superficie de la partícula confieren a las partículas un punto isoeléctrico de 4.4 y, por tanto, una fuerte carga negativa a pH fisiológico (pH 7.4). Esto permite su unión estable a moléculas cargadas positivamente a pH 7.4, como DOXO (DOXO-BMNPs), en base a interacciones electrostáticas, siguiendo el modelo de Langmuir-Freundlich, que muestra que la superficie de la magnetita es energéticamente heterogénea y exhibe una cooperatividad positiva. Por el contrario, cuando el pH disminuye (pH 5), estas interacciones electrostáticas se debilitan y DOXO se libera hasta ~35% de la cantidad inicialmente adsorbida en solo 4 horas. Además, estas BMNPs son cito y hemocompatibles, mientras que DOXO-BMNPs muestran citotoxicidad en la línea celular de carcinoma gástrico humano GTL-16 de una manera dependiente de la dosis. En el Capítulo III, el estudio in vitro de DOXO-BMNPs, iniciado en el Capítulo II, se completó con la adsorción estable del anticuerpo monoclonal (mAb) DO-24 en estos nanoensamblajes (DOXO-mAb-BMNPs). Este mAb reconoce el receptor Met/HGF humano, sobreexpresado en muchos tipos de cáncer, por lo que su unión a DOXO-BMNPs proporciona un sistema de quimioterapia dirigida. La adsorción de DOXO y/o el mAb no interfirió en las propiedades magnéticas de las partículas, ya que los diferentes nanoensamblajes mostraron la misma temperatura de bloqueo que las BMNPS. Por otro lado, DOXO-mAb-BMNPs reconocen selectivamente el receptor Met, se unen eficientemente a las células tumorales Met+ y descargan DOXO en sus núcleos de manera más eficiente que DOXO-BMNPs, ejerciendo citotoxicidad que, además, aumentó con la exposición celular a un gradiente de campo magnético (GMF). Además, la liberación de DOXO a pH 5 (microambiente tumoral), ya analizada en el Capítulo II, se combinó con un campo magnético alterno (AMF), lo cual produjo un aumento en la liberación de DOXO por la hipertermia generada. Por lo tanto, estos datos representan un enfoque potencial de doble transporte y liberación controlados (mediados por el mAb y magnético) y una terapia combinada (quimioterapia e hipertermia). Sin embargo, la evaluación de las interacciones de estos nanotransportadores con entornos biológicos es imprescindible para su segura y eficiente aplicación in vivo. En este contexto, en el Capítulo IV se realizó una investigación fundamental sobre la formación de proteínas corona (PC) alrededor de estos nanotransportadores después de su incubación en plasma humano. Las BMNPs o DOXO-BMNPs se sumergieron en plasma humano y se observó una cubierta de PC unida de manera estable (PC-BMNPs y PC-DOXO-BMNPs). En particular, el fibrinógeno se detectó como la proteína plasmática más abundante en las PC de las DOXO-BMNPs. Esto representa potenciales ventajas, en primer lugar, eliminar el exceso de fibrinógeno plasmático que está involucrado en la resistencia a la quimioterapia y, en segundo lugar, proteger a las partículas de la fagocitosis, prolongando así su tiempo de circulación. Además, la adsorción de PC a las BMNPs no alteró las propiedades magnéticas de las partículas, redujo su polidispersidad y mejoró su estabilidad coloidal, lo que redujo la toxicidad de las BMNPs en macrófagos humanos y mejoró su internalización en diferentes líneas celulares. Estos datos representan un estudio preliminar sobre las interacciones seguras y ventajosas que se producen entre las BMNPs/DOXO-BMNPs y el plasma humano, que permitieron el diseño de los experimentos in vivo realizados en el Capítulo V. En este Capítulo se evaluaron in vivo la orientación y concentración magnética de fármacos en sitios diana y la hipertermia magnética producidas por las BMNPs o DOXO-BMNPs. Las BMNPs mostraron una alta biocompatibilidad sin evidencia de alteraciones en los órganos. Bajo la influencia de un GMF, aumentó la internalización celular de las BMNPs en cortos períodos de tiempo, permitiendo una acumulación más rápida de DOXO en los núcleos de las células. Después de la inyección intravenosa de DOXO-BMNPs en ratones BALB/c con carcinomas mamarios inducidos por células 4T1 y la aplicación de un GMF se acumuló una alta concentración de nanopartículas en el tumor y el crecimiento tumoral se inhibió significativamente. Por otro lado, la inyección de DOXO-BMNPs in situ en carcinomas mamarios 4T1 inducidos en ratones, junto con la aplicación de un AMF, también provocó una disminución significativa del volumen tumoral mediada por la hipertermia producida por las nanopartículas y el consecuente aumento de la liberación de DOXO, que fue más eficiente que en los ratones solo tratados con DOXO soluble o con el AMF. En consecuencia, estos nanoportadores basados en BMNPs son potencialmente efectivos para el tratamiento local del cáncer, consistente en la orientación magnética de fármacos combinada con hipertermia magnética para aumentar su eficiencia. Finalmente, en el Capítulo VI, se utilizaron nanopartículas magnéticas en el contexto de la nanorremediación de aguas, diseñando un nuevo nanosistema magnético que combinara las ventajas del material magnético y el utilizado como soporte. En particular, se produjo un nuevo material magnético híbrido compuesto por nanopartículas magnéticas inorgánicas (MNPs) precipitadas en membranas de la cáscara de huevo (ESM), abundantes desechos biológicos de la industria de procesamiento de alimentos, como adsorbente verde para la preservación de los recursos naturales. Específicamente, se investigó la eliminación de metales pesados de ambientes acuosos utilizando estas ESM magnéticas (MESM). Las fibras de la ESM, que actuaron como una superficie activa para la nucleación de partículas, fueron decoradas con MNPs para facilitar su recolección utilizando un campo magnético externo sin la necesidad de un tratamiento adicional. En este contexto, se produjeron largas hebras de MNPs a lo largo de las fibras de la ESM en presencia de un campo magnético, mientras que en su ausencia se formaron aglomerados de partículas más pequeñas con una disposición aleatoria. Las MESMs presentaron gran capacidad para mejorar la eliminación de Pb de agua contaminada, mostrando un efecto sinérgico entre las MNPs y la ESM en la adsorción Pb. Sin embargo, la interacción con Pb fue mucho mayor para las MNPs de MESM, lo que aumentó la eficiencia de eliminación más de 10 veces en comparación con la del componente ESM solo. Estos resultados sugieren que las MESMs podrían utilizarse como agentes de nanorremediación eficientes en la separación/eliminación de iones de metales pesados u otros contaminantes en aguas contaminadas, siendo fácilmente recuperables magnéticamente y reutilizables. Magnetite (Fe3O4) nanoparticles are of great interest in biotechnology field since they have a large area surface, which can be used for anchoring relatively large amounts of specific molecules, and can be easily manipulated by using an external magnetic field because of their high magnetic moment per particle compared to other iron oxides. They can be synthesized inorganically using different processes but, generally, performed at high temperatures and pressures, which involves high costs of production. Moreover, these chemically-produced magnetites usually do not have all desirable features (i.e. high magnetization, consistent sizes and morphologies, biocompatibility or high chemical stability) for certain biomedical applications. Magnetotactic bacteria (MTB) synthesize magnetosomes comprised of membrane-enveloped single crystalline Fe3O4 by a strict genetic control in which are involved unique proteins called magnetosome-associated proteins (MAPs). This controlled biomineralization process (BCM) results in nanomagnetites with perfect crystal structures, high chemical purity, elongated morphologies and narrow size distribution (between 30 and 120 nm), making these crystals a single magnetic domain and, in consequence, the ideal magnetic nanoparticles. However, the scale up of such a production is not possible at present because of the exigent nutrition conditions of MTB and their slow growth, so magnetosomes cannot be obtained in large quantities. In fact, this is the bottleneck for the application of magnetosomes in nanotechnology. In this context, one of the proposed alternatives is biomimetic, i.e the in vitro production of magnetosome-like magnetic nanoparticle mediated by MAPs, since preferential interaction of MAPs with magnetite crystal has been suggested to explain the unique properties of the magnetites produced by MTB. However, there are still many unknowns related to the structure and function of most of the MAPs. So from a biological standpoint, as well as for the potential application of this biomimetic magnetite nanoparticles (BMNPs), understanding this BCM, the only one known so far in the domain Bacteria, represents a challenge of extraordinary importance. In this regard, in Chapter I of this Doctoral Thesis, the combined functions of two different MAPs, MamC and Mms6 of Magnetococcus marinus MC-1, have been studied for the first time to synthesize biomimetic magnetites. Our results show that MamC and Mms6 have different, but complementary, functions on in vitro magnetite nucleation and growth. MamC seems to control the kinetics of crystal nucleation, combining both ionotropic and template effects, while Mms6 seems to preferably control the kinetics of crystal growth by acting as a Fe reservoir. The combined effect of these MAPs produces in vitro well faceted crystals both large in size (30 ± 10 nm) and with higher blocking temperature, indicating larger magnetic moment per particle, compared to the particles synthesized in the absence of the MAPs or in the presence of only one of them. Therefore these new BMNPs with improved magnetic properties could be potentially useful in nanotechnological applications. Chapters II to V focus on the in vitro (II, III, IV) and in vivo (V) evaluation of the MamC mediated BMNPs as potential nanocarriers for antitumor therapies, since this MAP had been previously purified and extensively studied by our group. Chapter II includes the physicochemical characterization of these BMNPs and their functionalization with the chemotherapeutic drug doxorubicin (DOXO). These BMNPs were characterized as superparamagnetic (at 300K) nanoparticles of 30-40 nm, composed of 95 wt% of magnetite and 5 wt% of MamC, with an specific surface area of 90 m2/g. Moreover, the functional groups of MamC exposed in the particle surface confer to the particles an isoelectric point of 4.4 and, thus, a strongly negatively charged at physiological pH (7.4). This allows their stable complexation to positively charged molecules at pH 7.4, such as DOXO (DOXO-BMNPs), based on electrostatic interactions, following the Langmuir-Freundlich model, which shows that the surface of the magnetite is energetically heterogeneous and displays positive cooperativity. On the contrary, when pH decreases (pH 5), these electrostatic interactions weaken and DOXO is released up to ~ 35% of the amount initially adsorbed in only 4 hours. Moreover, these BMNPs are cyto- and hemocompatibles, while DOXO-BMNPs display cytotoxicity on the GTL-16 human gastric carcinoma cell line in a dose-dependent manner. In Chapter III the in vitro study of DOXO-BMNPs initiated in Chapter II was completed with the stable adsorption of the DO-24 monoclonal antibody (mAb) onto these nanoassemblies (DOXO-mAb-BMNPs). This mAb recognizes the human Met/HGF receptor, overexpressed in many types of cancer, so its complexation to DOXO-BMNPs provides a targeted chemotherapy system. The adsorption of DOXO and/or the mAb did not interfere in the magnetic properties of the particles, showing the different nanoassemblies the same blocking temperature as the BMNPS. The DOXO-mAb-BMNPs selectively recognize Met, bind efficiently to Met+ tumor cells, and discharge DOXO within their nuclei more efficiently than DOXO-BMNPs, exerting cytotoxicity that, in adition, was enhanced upon cell exposure to a gradient magnetic field (GMF). In addition, DOXO release at pH 5 (tumor microenvironment), already analyzed on Chapter II, was combined with an alternating magnetic field (AMF), which produce an increased in DOXO release by the hyperthermia generated. Therefore, these data represent a potential controlled dual targeting (mAb-mediated and magnetic) approach and combined (chemotherapy and hyperthermia) therapy. However, the evaluation of the interactions of these nanocarriers with biological environments is mandatory for their safe and efficient in vivo application. In this context, a fundamental investigation regarding the protein corona (PC) formation around these nanocarriers after incubation with human plasma was performed in Chapter IV. BMNPs or DOXO-BMNPs were immersed in human plasma and PC cover was observed (PC-BMNPs and PC-DOXO-BMNPs). In particular, fibrinogen was detected as the most abundant plasma protein in PC of DOXO-BMNPs. This potentially provides advantages by on one hand removing the excess plasma fibrinogen that is involved in chemotherapy resistance, and secondly protecting the particles from phagocytosis, thus, prolonging circulation time. Moreover, the adsorption of PC to the BMNPs did not alter the magnetic properties of the particles, reduced their polydispersity, and improved their colloidal stability. This reduced BMNPs toxicity in human macrophages and enhanced their internalization in different cell lines. Therefore, these data represent a preliminary study of the safe and advantageous interactions that occur between BMNPs/DOXO-BMNPs and human plasma, which allowed the settings of the in vivo experiments performed in Chapter V. In this Chapter, the in vivo magnetic drug targeting and magnetic hyperthermia produced by BMNPs or DOXO-BMNPs were evaluated. The BMNPs showed high biocompatibility without evidence of organ alterations. Under the influence of the GMF, BMNPs increased their cellular uptake in short periods of time, which promotes a faster DOXO accumulation in cell nuclei. After intravenous injection of DOXO-BMNPs in BALB/c mice bearing 4T1 induced mammary carcinomas and the application of the GMF, a high concentration of BMNPs accumulated at the tumor site and tumor growth was significantly inhibited. On the other hand, the tumor in situ injection of DOXO-BMNPs in 4T1 tumor bearing mice together with the application of an AMF, also resulted in a significant tumor volume decrease mediated by the hyperthermia produced by the nanoparticles and the consequent increase in DOXO release, which was more efficient than in mice only treated with soluble DOXO or with the AMF. Therefore, these BMNPs nanocarriers are potentially effective for local cancer treatment consisting of magnetic drug targeting combined with magnetic hyperthermia to increase efficiency. Finally, in Chapter VI, a new hypbrid magnetic material composed of inorganic magnetic nanoparticles (MNPs) precipitated on eggshell membranes (ESM), an abundant biowaste from the food processing industry, was applied as green adsorbent for natural resources preservation. Specifically, heavy metal removal from aqueous environments was investigated by using these magnetic ESM (MESM). The ESM fibers, which acted as an active surface for particle nucleation, were decorated with the MNPs in order to facilitate their collection using an external magnetic field without the need for further treatment. In this context, long strands of MNPs along the fibers of the ESM were produced in the presence of the magnetic field, while agglomerates of smaller particles with a random disposition were formed in its absence. The MESMs present high capacity to improve the removal of Pb2+ from contaminated water, showing a synergistic effect between the MNPs and the ESM adsorbing Pb2+. However, the interaction with Pb2+ was much greater for the MNPs of MESM, which increased the efficiency of the removal more than 10 times compared to that of the ESM component alone. These results suggest the MESMs could be utilized as an efficient nanoremediation agent for separation/removal of heavy metal ions or other charged pollutants from contaminated waters, being easily magnetically recoverable and recyclable.