Impacto de la comunidad microbiana presente en bentonitas sobre los procesos biogeoquímicos del sistema ternario bentonita/microorganismo/radionucleidoimplicaciones para el concepto de almacenamiento geológico profundo de residuos nucleares

Resumen

1. INTRODUCCIÓN El Almacenamiento Geológico Profundo (AGP) es una prioridad internacional, actualmente se considera como una de las opciones más seguras para el almacenamiento de residuos radiactivos de alta actividad. Este sistema multibarrera consiste en encapsular el los residuos nucleares en contenedores metálicos (de hierro fundido, acero inoxidable o cobre), rodeados por bentonita compactada (barrera artificial) que se colocarán a varios cientos de metros de profundidad dentro de una roca hospedante (barrera natural). El uranio (U) y el selenio (Se) se consideran los radionucleidos más relevantes entre los residuos nucleares. Sus efectos nocivos sobre la estructura y las funciones del ecosistema dependen, en gran medida, de su movilidad y biodisponibilidad. Los microorganismos pueden afectar potencialmente la especiación química de los radionucleidos y, en consecuencia, su migración sirviéndose de varios procesos tales como la biosorción, la biomineralización, la acumulación intracelular, y la biotranformación. En caso de que se produzca una fuga accidental de los elementos radiactivos que forman parte de los residuos nucleares, estos procesos pueden darse en el AGP y así controlar la movilización de los radionucleidos. Además, los microorganismos presentes en las bentonitas pueden producir un efecto en la estructura y la estabilidad de estas arcillas mediante la biotransformación de minerales que contienen hierro. 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El buen funcionamiento del AGP está relacionado con un mejor conocimiento de los mecanismos de interacción entre los radionucleidos y los microorganismos que habitan las diferentes barreras del AGP. Por ello, se tomaron muestras de la formación geológica de bentonitas localizada en El Cortijo de Archidona (Almería, Spain). Esta bentonita se ha utilizado en todos los experimentos que se han desarrollado en esta Tesis Doctoral. En primer lugar, se elaboraron dos series de microcosmos tratados con nitrato de uranilo (U; 1,26 mM) y glicerol-2-fosfato (G2P, 10 mM). Una de las series fue incubada aeróbicamente y la otra en anaerobiosis durante 6 meses a temperatura ambiente. Los análisis por secuenciación del gen ARNr 16S de segunda generación (Next Generation Sequencing en inglés, NGS) reveló la presencia de diferentes comunidades bacterianas en los dos tipos de microcosmos. En los microcosmos aeróbicos, las Actinobacterias y las Proteobacterias fueron los filos dominantes. El G2P y el nitrato indujeron el enriquecimiento de las bacterias implicadas en los ciclos biogeoquímicos del nitrógeno y del carbono (p. ej. Azotobacter), así como el uranio estimuló de forma significativa la presencia de bacterias sulfato-reductoras (Desulfonauticus y Desulfomicrobium) en los microcosmos correspondientes (U). La actinobacteria, Amycolatopsis se vio enriquecida en las bentonitas tratadas con una combinación de G2P y U. La capacidad de esta bacteria, junto con un consorcio procedente de la bentonita (Bradyrhizobium-Rhizobium y Pseudomonas), para precipitar el uranio en minerales de fosfatos de uranio (debido a la actividad fosfatasa), fue demostrada mediante técnicas dependientes de cultivo y microscopía electrónica de transmisión. Por su parte, los microcosmos anaeróbicos se caracterizaron por la presencia de 29 filos, entre ellos Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Verrucomicrobia. Se detectaron cepas bacterianas de gran relevancia ecológica en estos microcosmos, incluyendo por un lado las bacterias sulfato-reductoras (p. ej. Desulfatiglans), y las oxidadoras de azufre (p. ej. Sulfurimonas y Thiobacillus) que fueron identificadas en los microcosmos tratados con U, y, por otro lado, Pseudomonas y Desulfovibrio en los microcosmos tratados con U y G2P. Estas últimas, son conocidas por su capacidad para inmovilizar U como fosfatos U por biomineralización y reducción enzimática de U(VI) a U(IV), respectivamente. Además, las bacterias oxidadoras de Mn(II) probablemente pudieron afectar el ciclo biogeoquímico del Mn al concentrar e inmovilizar este elemento en las bentonitas produciendo la formación de óxidos de Mn(IV). En esta tesis doctoral se desarrolló y propuso un protocolo optimizado que facilita la extracción de ADN de la bentonita. Dicho protocolo con mayores rendimientos basado en el método clásico de extracción con fenol:cloroformo en combinación con tratamientos previos de lisis mecánica y química, proporcionó suficiente ADN bacteriano (2-6 ng/μL) para realizar NGS y obtener datos válidos de la diversidad microbiana. Al ser considerado como el método más efectivo para la bentonita, en comparación con otros métodos basados en kits comerciales, este protocolo se utilizó en todos los experimentos que requerían de extracción de ADN, incluyendo la de bentonitas compactadas. La bentonita compactada como material de relleno y sellado ha sido propuesta, comúnmente, para su uso en el AGP actuando como barrera artificial. Sin embargo, aún se requiere profundizar en el conocimiento del comportamiento de dicha estructura después de su colocación en el repositorio, incluyendo el estudio de los microorganismos naturales de la bentonita, su supervivencia y movilidad. Por lo tanto, las muestras de bentonita no tratadas y tratadas con acetato se compactaron a dos densidades secas diferentes (1,5 y 1,7 g/cm3) y se incubaron durante 24 meses en condiciones anaeróbicas a temperatura ambiente. La NGS demostró que los filos Actinobacteria y Proteobacteria fueron dominantes en estas muestras. Dentro de las Actinobacterias, Arthrobacter fue el género más abundante en las muestras de tiempo 0, y éste junto con Pseudoarthrobacter fueron dominantes tras 24 meses de incubación. Además, se obtuvieron resultados interesantes en cuanto a la microbiota de estas muestras pues se identificaron bacterias reductoras de Fe (p. ej. Geobacillus, Thermicanus, y Stenotrophomonas), oxidadoras de hierro (p. ej. Thiobacillus, Syderoxidans, y Rhodobacter), oxidadoras de azufre (p. ej. Thiobacillus, Delftia, Sulfurifustis, y Sulfurimonas) y sulfato-reductoras (p. ej. Pseudomonas, Desulfuromonas, Desulfoporosinus) que son conocidas por la utilización de acetato como fuente de carbono para su crecimiento. En el futuro AGP, Se79 podría ser otro radioisótopo crítico debido a su actividad de larga vida media y su especiación química dependiente del estado de oxidación (VI, IV, 0 y -II). Por lo tanto, el impacto de Se(IV) sobre la diversidad microbiana de bentonita se ha estudiado aquí por primera vez, destacando la capacidad de algunos microorganismos para reducir este elemento a Se(0) e influir en su estructura. Los microcosmos de bentonitas de Cabo de Gata saturadas de agua se trataron con selenito, Se(IV), acetato, G2P, inoculados con un consorcio bacteriano BSPAS (formado por Bacillus, Stenotrophomonas, Pseudomonas, Amycolatopsis, y Shewanella) y fueron incubados anaeróbicamente durante 6 meses a temperatura ambiente. En este estudio, la NGS reveló la presencia de Bacteria (principalmente Firmicutes y Proteobacteria) y Archaea (principalmente Methanosarcina). Pseudomonas y Stenotrophomonas fueron identificadas en los microcosmos no inoculados con el consorcio BSPAS, junto con Desulfosporosinus, y géneros no-clasificado afiliados a Desulfuromonadaceae, Clostridia, and Firmicutes, todos ellos, probablemente, están implicados en la reducción del Se(VI) a Se elemental. Además, se observaron cambios en el color de la bentonita, de transparente a negro con una fase intermedia de color naranja a lo largo del tiempo de incubación. Se encontraron nanoestructuras de Se(0) en los microcosmos tratados con Se(IV) confirmando la reducción de Se(IV) al selenio metálico. Las capas anaranjadas analizadas estaban compuestas por nanoesferas de Se amorfo o de fases cristalinas de Se monoclínico, mientras que los precipitados negros mostraron la estructura típica del selenio trigonal (la forma más estable de Se), cuando estaban presentes tanto las bacterias naturales de la bentonita como las inoculadas con el consorcio BSPAS. Estos resultados confirmaron un proceso de biotransformación de nanoesferas de Se amorfo/monoclínico a Se trigonal estable en las bentonitas tratadas con Se(IV). 3. CONCLUSIONES En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral resaltan muchos aspectos del funcionamiento y la seguridad de los futuros DGR, por un lado, el papel que las comunidades microbianas desempeñarían afectando así las propiedades óptimas de cualquier tipo de bentonita (bentonita compactada y no compactada) y, por otro lado, los efectos que estas comunidades pueden tener al retener radionucleidos relevantes (U y Se) como resultado de alguna fuga accidental que pudiera tener lugar durante la larga vida útil del AGP. Finalmente, se muestran y analizan los efectos sobre los procesos biogeoquímicos en los que intervienen microorganismos que comprometen la seguridad del repositorio. En general, esta Tesis Doctoral proporciona nuevos conocimientos sobre el desarrollo de tratamientos apropiados de residuos, remediación y estrategias de gestión a largo plazo.