Estrategias analíticas para la caracterización estructural de anticuerpos monoclonales terapéuticos y proteínas de fusión mediante espectrometría de masas

Zusammenfassung

En esta Tesis se han desarrollado y puesto a punto estrategias analíticas para la evaluación de aspectos que afectan a la calidad de mAb y proteínas de fusión mediante espectrometría de masas. Para alcanzar los objetivos propuestos se han realizado cuatro estudios experimentales que serán expuestos en cada uno los capítulos que la conforman. Los tres primeros estudios han sido desarrollados en el análisis de anticuerpos monoclonales y el último ha sido aplicado sobre una proteína de fusión. En el primer capítulo se ha detallado una estrategia analítica para la comparación de espectros de masas complejos procedentes de las huellas dactilares peptídicas obtenidas mediante espectrometría de masas MALDI/TOF tras digestión enzimática. Para llevar a cabo la primera parte de la estrategia, se ha desarrollado una función matemática sobre Matlab, denominada "Protiago". Esta función realiza un pre-procesado de datos para que puedan ser analíticamente comparados mediante técnicas quimiométricas. Se ha aplicado el análisis de similitud y se ha desarrollado un nuevo índice llamado "Índice de proximidad". Para conocer la agrupación y la relación natural de los datos dos métodos exploratorios de datos han sido aplicados, análisis de componentes principales (PCA) y análisis multivariante de la varianza (MANOVA). Esta metodología ha sido aplicada a un estudio de estabilidad en el tiempo de los anticuerpos monoclonales infliximab y rituximab. Se ha podido comprobar que las modificaciones estructurales más importantes son causadas las primeras 24 horas. El segundo estudio que se ha presentado es un método analítico que permite la separación, identificación y cuantificación de mAb terapéuticos en mezclas mediante un método de ultra altas prestaciones de cromatografía de líquidos en fase inversa, acoplada a dos sistemas de detección en línea, esto es, absorción en el ultravioleta y espectrometría de masas de alta resolución (RP)UHPLC-UV-(HESI/Orbitrap)MS. Se han analizado 5 mAb terapéuticos: bevacizumab, cetuximab, infliximab, rituximab y trastuzumab. El método se ha optimizado mediante la aplicación de diseño estadístico de experimentos (DoE). Mediante espectrometría de masas se han identificado y caracterizado el perfil de isoformas de los anticuerpos monoclonales estudiados. Tanto el método de detección por absorción en el ultravioleta como el método utilizando espectrometría de masas han sido validados mediante el estudio de determinados parámetros de calidad del método como linealidad, exactitud (precisión y veracidad), límites de detección y cuantificación y robustez. La identificación de los mAb fue también validada mediante la comparación de espectros obtenidos mediante un método de inyección directa en el espectrómetro de masas desarrollado en este trabajo. Se ha discutido el uso de diferentes modificadores de la fase móvil como son el ácido trifluoroacético y el ácido fórmico. Como tercer trabajo se presenta un estudio comparativo aplicando diferentes enfoques analíticos ('top-down', 'middle-down' y bottom up') para la caracterización del patrón de N-glicosilación de cuatro anticuerpos monoclonales terapéuticos: bevacizumab, infliximab, rituximab y trastuzumab. Se han desarrollado diferentes métodos analíticos de cromatografía de líquidos de ultra altas prestaciones acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Los dominios de análisis son los siguientes: (i) proteína intacta usando condiciones desnaturalizantes y nativas; (ii) caderas pesadas y ligeras (bajo condiciones reducidas); (iii) región Fc intacta (digestión con gingipain); (iv) cadenas simples de la región Fc (digestión con IdeS); v) proteína completa por mapeo peptídico (digestión con tripsina); y vi) los N-glicanos liberados de la parte proteica (marcados con dos sustancias diferentes, 2 AA y 2 AB). Los métodos han sido comparados entre sí en función de la calidad de información suministrada, el nivel de experiencia del analista, la instrumentación requerida para la preparación de muestra y el análisis de datos, la relevancia e idoneidad de los datos obtenidos para la caracterización estructural y la comparación lote a lote. El último trabajo reúne un estudio comparativo entre dos estrategias de cromatografía de intercambio catiónico (CXC) para el análisis de las variantes de carga de la proteína de fusión ziv-aflibercetp (ziv-AFL). La primera estrategia usa sales volátiles en la composición de la fase móvil con el fin de acoplar el sistema cromatográfico con detección a espectrometría de masas de alta resolución, la otra estrategia usa sales no volátiles clásicas con fuerza iónica elevada mediante detección UV. Se aplicó DoE para ajustar las condiciones cromatográficas del primer método publicado de CXC acoplado a detección de espectrometría de masas de alta resolución para el análisis de las variantes de carga de ziv-aflibercetp (ziv-AFL). El método que usa sales no volátiles fue desarrollado y optimizado en este trabajo. Tanto muestras frescas como estresadas de ziv-AFL se analizaron para evaluar la capacidad de ambas estrategias CXC para la detección de variantes de carga. La estrategia CXC que usa sales no volátiles en las fases móviles ha proporcionado una mejor detección de los perfiles de carga de ziv-AFL tanto en muestras frescas como estresadas que la estrategia que usa sales volátiles. Por otro lado, la complejidad de los datos generados mediante espectrometría de masas ha hecho imposible la identificación de variantes de carga de ziv-AFL.