Importancia de las células madre tumorales (CSCs) y de las metaloproteasas (MMPs) en respuesta a la radiación en cáncer de mama

Resumen

1. INTRODUCCIÓN El cáncer es la segunda causa de muerte en el mundo. Los tipos de cáncer responsables de más fallecimientos son: pulmonar, hepático, colorrectal, gástrico y mamario [1]. El cáncer de mama es el tumor más común en las mujeres y a nivel mundial, en términos de mortalidad, ocupa el quinto lugar de todas las muertes causadas por cáncer [2]. El pronóstico del cáncer de mama viene determinado por la heterogeneidad de la enfermedad, el tipo de tumor (desde un punto de vista histológico y molecular), la localización tumoral, el grado de diferenciación, la presencia o ausencia de diferentes proteínas (E-cadherina, p53, Ki67), la afectación del ganglio centinela, y la edad del paciente; los cuales también intervienen en la respuesta al tratamiento [3]. La radioterapia (RT) se usa en el tratamiento de la mayoría de los tumores [4]. La selección de un régimen radioterápico adecuado depende de la dosis umbral, de las características del paciente, y de los tejidos y órganos donde se encuentra ubicado el tumor [5]. En cáncer de mama, ha sido ampliamente utilizada la RT convencional (2 Gy/fracción diarios; 45-50 Gy totales), pero cada vez es más usada la RT hipofraccionada, implicando dosis de radiación más altas en tiempos más cortos de tratamiento [6-9]. En cáncer de mama, la toxicidad cutánea es el efecto adverso más común y suele presentarse como eritema, descamación, ulceración y hemorragia (efectos agudos) e hiperpigmentación y telangiectasia (efectos crónicos). La eficacia total obtenida con la RT depende de la dosis umbral, el régimen radioterápico, la ubicación del tumor, la toxicidad y la resistencia presentada por los pacientes frente a este tratamiento [4-5]. Dicha radioresistencia se debe a la heterogeneidad y complejidad biológica que presentan ciertos tumores y, principalmente, a las células madre tumorales (CSCs) presentes en ellos [10]. Las CSCs son una pequeña proporción de células dentro del tumor [11] que son capaces de originar, mantener y expandir tumores [11-12], de autorenovarse, de sobrevivir en el torrente sanguíneo, y de resistir a los tratamientos oncológicos (RT y quimioterapia) [12-14]. En el caso de la RT, la radioresistencia presentada por las CSCs es debida a su capacidad de recuperación frente a las lesiones inducidas por la radiación mediante la gran capacidad de reparación del DNA, la activación de puntos de control en el ciclo celular así como de distintas vías de supervivencia (Hedgehog, Notch, Wnt/β-catenina) y de señales procedentes del entorno extracelular (nicho y microambiente) [15]. Debido a esto, las CSCs están relacionadas con los procesos de metástasis y recurrencia tumoral [16-19] y, por tanto, están siendo candidatas como nuevas perspectivas terapéuticas [20]. Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son endopeptidasas que difieren en su estructura, especificidad de sustrato, homología de secuencia, localización celular y secreción [21]. Las MMPs participan principalmente en la remodelación de la matriz extracelular (ECM) [22], pero también son capaces de procesar proteínas no relacionadas con dicha matriz, de activar otras MMPs [23], de regular las interacciones célula-célula [24], y están involucradas en el recambio de fibras estromales [25]. Además, participan en gran variedad de procesos biológicos normales [24] y carcinogénicos (crecimiento tumoral, evasión de apoptosis, angiogénesis, respuesta a la inflamación, transición epitelial-mesenquimal (EMT), formación de nichos premetastásicos, invasión y metástasis) [26-27]. Hay evidencias de que dichos procesos carcinogénicos se favorecen tras la radiación por un aumento de la actividad de las MMPs, la cual necesita ser regulada por inhibidores tisulares endógenos de las MMPs (TIMPs) y, mediante mecanismos epigenéticos, por histonas desacetilasas (HDACs) [21]. Los TIMPs no sólo son inhibidores de las MMPs, sino que también tienen actividades biológicas independientes de ellas, como son el crecimiento y la diferenciación celular, la angiogénesis, la apoptosis y la plasticidad sináptica [28]. Las HDACs son enzimas que participan en el silenciamiento de genes mediante la eliminación de grupos acetilo de la cromatina. El proceso de desacetilación de las histonas favorece la evasión de la apoptosis e induce la no respuesta a señales antiproliferativas [29]. El microambiente del tejido es fundamental para la forma, la función, el desarrollo y el crecimiento del tejido [30-31]. Teniendo en cuenta la importancia de las interacciones célula-célula y célula-ECM, los cultivos celulares tridimensionales (3D) están siendo una herramienta esencial en el desarrollo celular y en la biología del cáncer. Además, se han convertido en una válida alternativa al uso de los modelos animales, debido a que imitan las condiciones in vivo a través de un microambiente controlado y reproducible [32]. 2. OBJETIVOS 1. Identificar la proporción de CSCs en tres líneas celulares tumorales de cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-231 y SK-BR-3) tras la administración de distintas dosis de radiación (0, 2 y 6 Gy). 2. Cuantificar las distintas proteínas secretadas (MMPs, TIMPs y HDACs) en distintas subpoblaciones celulares (incluyendo la de CSCs), tras la administración de diferentes dosis de radiación (0, 2 y 6 Gy) en las tres líneas celulares tumorales de cáncer de mama. 3. Comprobar las modificaciones, en caso de que haya, tras la irradiación de MMPs, TIMPs y HDACs entre estudios in vitro (experimental) e in vivo (ratones y pacientes). 4. Examinar el comportamiento de MMPs, TIMPs y HDACs tras la radiación para poder estudiarlas como posibles biomarcadores predictivos y de pronóstico en el cáncer de mama, debido a su relación en la invasión y metástasis tumoral. 3. MATERIAL Y MÉTODOS En esta Tesis Doctoral se llevaron a cabo distintos estudios in vitro con tres líneas celulares tumorales de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-231 y SK-BR-3) y una línea celular de fibroblastos adultos humanos (HAF) derivados de piel. Las líneas celulares tumorales se cultivaron en 2D (monocapa) y 3D (suspensión) y 24 horas después de ser irradiadas a 0, 2 y 6 Gy, se determinaron los marcadores específicos de CSCs de mama: ALDH1, CD44+ y CD24-/low. Las tres líneas celulares tumorales también fueron separadas mediante citometría de flujo en distintas subpoblaciones celulares (general, positiva o CSCs, y negativa o no-CSCs), las cuales se cultivaron en 3D y 3D+lrECM (Matrigel) y a las 24 horas de irradiarlas a 0, 2 y 6 Gy, se determinó la expresión génica de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, HDAC-1, HDAC-2 y HDAC-4 mediante qRT-PCR. Además, las líneas celulares tumorales se co-cultivaron en Matrigel con HAF y 24 horas después de ser irradiadas a 0, 2 y 6 Gy, se determinó la expresión de los genes citados anteriormente. En esta Tesis Doctoral también se llevó a cabo tanto un estudio in vivo en ratones como un estudio piloto en pacientes de cáncer de mama. El estudio en ratones consistió en la monitorización del crecimiento tumoral tras la inoculación ortotópica en Matrigel de las tres subpoblaciones celulares (general, positiva o CSCs y negativa o no-CSCs) de la línea MDA-MB-231, tras haber sido irradiadas a 0, 2 y 6 Gy. Los tumores obtenidos se sumergieron en parafina y se cortaron en secciones, en las cuales se realizó una tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) y una tinción inmunohistoquímica (IHC) de MMP-1. El estudio piloto consistió en la determinación proteica de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-12, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4 mediante inmunoensayo, en 3 muestras de suero de pacientes obtenidas a distintos tiempos del tratamiento (antes, durante y después de la RT). Los niveles séricos de estas proteínas también se estudiaron de acuerdo a distintas variables (dependientes de las pacientes, dependientes de la biología tumoral y relacionadas con la RT) y según la recurrencia de las pacientes a los 6 meses de finalizar el tratamiento. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la determinación de marcadores específicos de CSCs de mama (ALDH1, CD44+ y CD24-/low) tras radiación, vimos que la expresión de dichos marcadores varió en función del modelo de cultivo utilizado. En términos generales, el nivel de expresión de ALDH1 disminuyó con la radiación en ambos modelos de cultivo en las tres líneas celulares tumorales. Sin embargo, la expresión de CD44+ aumentó con la radiación en el cultivo 3D, el cual contenía la subpoblación positiva, es decir, la subpoblación de CSCs. Dicho marcador se ha asociado con la EMT [33] y con un mal pronóstico en cáncer de mama y, además, está involucrado en la resistencia a la RT y la QUIMIOTERAPIA en varios tipos de cánceres [34-36]. En las medidas de expresión génica en cultivos 3D y 3D+lrECM tras radiación, cada línea tumoral expresó diferentes genes. Nuestros resultados mostraron que con la radiación los niveles de expresión de MMP-1 y MMP-3 aumentaron en la subpoblación positiva (CSCs) en la línea MDA-MB-231 en ambos modelos de cultivo, siendo más altos en las células cultivadas en 3D+lrECM. Por tanto, sugerimos que este modelo de cultivo podría contribuir a la aparición de un fenotipo de MDA-MB-231 más agresivo tras la radiación. Además, también destacaron los niveles de MMP-9 y MMP-13 en la misma línea tumoral en el cultivo 3D. La MMP-9 es una de las principales responsables en la remodelación de la ECM [22, 37], y la MMP-13 está involucrada en el crecimiento tumoral mediante una regulación de la actividad y la biodisponibilidad de los factores de crecimiento secuestrados en la ECM [38]. En cuanto a las HDACs, hemos encontrado que las alteraciones producidas por la radiación pueden depender de la dosis administrada y de la subpoblación celular estudiada; lo que podría alterar la regulación que ejercen sobre las MMPs tras dicha radiación. Con respecto a los TIMPs, de forma general vimos un aumento en los niveles de expresión de TIMP-1 en el cultivo 3D+lrECM, y de TIMP-2 en el cultivo 3D, mostrando significancia estadística al comparar las subpoblaciones celulares. En la determinación de expresión génica en co-cultivos en Matrigel tras radiación, se detectaron los mismos genes en las tres líneas celulares tumorales. Nuestros resultados mostraron un aumento significativo en la expresión de la mayoría de los genes a la dosis de 6 Gy en las tres líneas celulares tumorales, pero principalmente, en la línea tumoral MDA-MB-231. En la monitorización del crecimiento tumoral en ratones, pudimos ver que dicho crecimiento no sólo depende de la dosis de radiación sino también de la subpoblación celular estudiada. El tumor de mayor volumen se obtuvo en la subpoblación general, la cual contiene tanto CSCs como no-CSCs. También vimos que los tumores derivados de las células irradiadas a 2 Gy en las subpoblaciones general y positiva, conteniendo ambas la fracción de CSCs, han presentado un volumen mayor con respecto al control no irradiado. Esto apoyaría la idea de que la dosis de 2 Gy sería insuficiente para erradicar las CSCs debido a la radioresistencia que éstas presentan, y que además esta dosis sería capaz de promover el crecimiento del tumor. Dicho efecto fue más pronunciado en los tumores correspondientes a la subpoblación general, lo que sugiere la importancia de las interacciones entre CSCs y no-CSCs en la proliferación tumoral después de la radiación. Sin embargo, las dosis más altas de radiación (6 Gy) se asocian con un retraso en el crecimiento del tumor, probablemente debido a la muerte de las CSCs. Estos resultados estarían apoyando la relevancia clínica de los regímenes hipofraccionados en cáncer de mama. En la determinación de los niveles séricos de MMPs en pacientes de cáncer de mama a lo largo de la RT, encontramos una correlación positiva entre éstos antes, durante y después de la RT, siendo dicha correlación más fuerte con la radiación. En el curso temporal del tratamiento, la mayoría de las MMPs analizadas aumentaron de forma no significativa, siendo los niveles de MMP-2 y MMP-9 los más altos. Con respecto a los TIMPs, encontramos correlaciones positivas y negativas entre sus niveles séricos según el momento de la RT, con un aumento en las correlaciones negativas para TIMP-1 y TIMP-3 con la radiación. A lo largo del tratamiento, los niveles séricos de TIMP-1 y TIMP-3 disminuyeron, lo cual podría estar asociado con el aumento de algunas MMPs estudiadas en este trabajo. En cuanto a las variables estudiadas, encontramos valores significativos al relacionar los niveles séricos de MMP-3 con el estado menopáusico, la clasificación tumoral, el grado de diferenciación y la presencia de E-cadherina; y al relacionar los niveles séricos de MMP-9 con la radiotoxicidad. En cambio, entre los TIMPs encontramos significancia en los niveles séricos de TIMP-3 al relacionarlos con la RT de los ganglios linfáticos y la radioresistencia; y al relacionar los niveles séricos de TIMP-4 con la presencia de E-cadherina, el portanje de Ki67 y la afectación del ganglio centinela. Finalmente, al comparar los niveles séricos de proteínas según la recurrencia tumoral 6 meses después del tratamiento, obtuvimos un aumento en la mayoría de MMPs y TIMPs después de la RT en las pacientes con recidiva tumoral. Estas variaciones no fueron estadísticamente significativas, pero estarían apoyando la influencia de las MMPs en el desarrollo de la carcinogénesis y su relación con un mal pronóstico en cáncer de mama. 5. CONCLUSIONES 1. La expresión de los marcadores de CSCs de mama (ALDH1, CD44+ y CD24-/low) varía con la dosis de radiación administrada. En la subpoblación positiva (CSCs), a dosis altas (6 Gy) aumenta el CD44+, el cual se asocia con la EMT y un mal pronóstico en cáncer de mama. 2. En los estudios in vitro de cultivo 3D y 3D+lrECM, la expresión de MMPs, TIMPs y HDACs varía en función de la línea tumoral (MCF-7, MDA-MB-231 y SK-BR-3), la dosis de radiación (0, 2 y 6 Gy), la subpoblación celular (general, positiva o CSCs, y negativa o no-CSCs) y el modelo de cultivo 3D (esferas en suspensión o embebidas en Matrigel). 3. Tras la irradiación celular y en ambos modelos de cultivo 3D, la MMP-1 aumenta su expresión en la subpoblación positiva (CSCs) de la línea triple negativa MDA-MB-231, la cual es la más radioresistente. Este hecho sugiere la importancia de MMP-1 en el proceso de invasión y metástasis tras el tratamiento con radiación. 4. El microambiente tumoral también se altera tras el tratamiento con radiación, afectando a la expresión de MMPs, TIMPs y HDACs. 5. En el estudio in vitro de co-cultivo (líneas celulares tumorales con fibroblastos), en general, la mayoría de genes estudiados aumentan su expresión a dosis altas de radiación. Este comportamiento apoya la importancia de los componentes del microambiente tumoral (entre ellos, fibroblastos) en la progresión de la enfermedad. 6. En el estudio in vivo, los tumores formados a partir de células MDA-MB-231 irradiadas a 2 Gy previo a la inoculación han sido de mayor volumen con respecto al control en las subpoblaciones general y positiva. Este hecho pone de manifiesto que dosis bajas de radiación serían insuficientes para erradicar las CSCs debido a su radioresistencia, contribuyendo al crecimiento tumoral. 7. En el desarrollo tumoral in vivo, los tumores formados a partir de células MDA-MB-231 irradiadas a 6 Gy previo a la inoculación han sido los más pequeños dentro de cada subpoblación celular. Este resultado sugiere que a dosis altas de radiación (6 Gy) se reduce la velocidad de crecimiento tumoral y el volumen final del mismo. 8. El estudio piloto realizado en pacientes con cáncer de mama pone de manifiesto que la RT induce alteraciones en los niveles séricos de MMPs y TIMPs. 9. Las pacientes de cáncer de mama con recidiva tumoral muestran un aumento en los niveles séricos de todas las MMPs analizadas y una disminución en los niveles de TIMP-1. Este hecho apoya la teoría de que TIMP-1 es el principal inhibidor de las MMPs y el más afín a ellas. Es importante considerar que el tamaño muestral es pequeño y se requieren estudios adicionales para corroborar estos hallazgos. 10. Finalmente, los resultados obtenidos en este trabajo confirman la importancia del microambiente y sus componentes, y de las CSCs en el desarrollo tumoral y en la respuesta al tratamiento con radiación. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Organizadión Mundial de la Salud. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/cancer. 2. Global Cancer Observatory. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.uicc.org/new-global-cancer-data-globocan-2018. 3. American Cancer Society. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.cancer.org/cancer/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/types-of-breast-cancer.html 4. Hendry JH. Radiation biology and radiation protection. Ann ICRP. 2012; 41 (3-4): 64-71. doi: 10.1016/j.icrp.2012.06.013. 5. de Felice F, Ranalli T, Musio D, et al. 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The types of cancer responsible for the most deaths are: lung, liver, colorectal, gastric and breast [1]. Breast cancer (BC) is the most common tumor in women and globally, in terms of mortality, it ranks fifth of all deaths caused by cancer [2]. The prognosis of BC is determined by the heterogeneity of the disease, the type of tumor (from a histological and molecular point of view), the tumor location, the degree of differentiation, the presence or absence of different proteins (E-cadherin, p53, Ki67), the involvement of the sentinel lymph node, and the age of the patient; which also intervene in the response to treatment [3]. Radiation therapy (RT) is used in the treatment of most tumors [4]. The selection of a suitable radiotherapy regimen depends on the threshold dose, on the characteristics of the patient, and on the tissues and organs where the tumor is located [5]. In BC, conventional RT has been widely used (2 Gy/daily fraction, 45-50 Gy total), but it hypofractionated RT is increasingly used, involving higher doses of radiation in shorter times of treatment [6-9]. In BC, cutaneous toxicity is the most common adverse effect and usually presents as erythema, desquamation, ulceration and hemorrhage (acute effects) and hyperpigmentation and telangiectasia (chronic effects). The total efficacy obtained from RT depends on the threshold dose, the RT regimen, the location of the tumor, the toxicity and the resistance presented by the patients to this treatment [4-5]. This radioresistance is due to the heterogeneity and biological complexity of certain tumors and, mainly, to the cancer stem cells (CSCs) present in them [10]. CSCs are a small proportion of cells within the tumor [11] that are capable of originating, maintaining and expanding tumors [11-12], to self-renew, of surviving in the bloodstream, and of resisting oncological treatments (RT and chemotherapy) [12-14]. In the case of RT, the radioresistance presented by the CSCs is due to their ability to recover from radiation-induced injuries by the capacity of DNA repair, the activation of control points in the cell cycle as well as different survival pathways (Hedgehog, Notch, Wnt/β-catenin) and signals from the extracellular environment (niche and microenvironment) [15]. Because of this, CSCs are related to the processes of metastasis and tumor recurrence [16-19] and, therefore, are being candidates as new therapeutic perspectives [20]. Matrix metalloproteases (MMPs) are endopeptidases that differ in structure, substrate specificity, sequence homology, cell localization, and secretion [21]. MMPs are mainly involved in the remodeling of the extracellular matrix (ECM) [22], but they are also capable of processing proteins unrelated to said matrix, of activating other MMPs [23], of regulating cell-cell interactions [24], and are involved in the replacement of stromal fibers [25]. In addition, they participate in a great variety of normal biological processes [24] and carcinogenic (tumor growth, evasion of apoptosis, angiogenesis, response to inflammation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), formation of premetastatic niches, invasion and metastasis) [26-27]. There is evidence that said carcinogenic processes are favored after radiation by an increase in the activity of the MMPs, which needs to be regulated by endogenous tissue inhibitors of the MMPs (TIMPs) and, by epigenetic mechanisms, by histone deacetylases (HDACs) [21]. TIMPs are not only inhibitors of MMPs, but also have biological activities independent of them, such as cell growth and differentiation, angiogenesis, apoptosis and synaptic plasticity [28]. HDACs are enzymes that participate in the silencing of genes by removing acetyl groups from chromatin. The deacetylation process of histones favors the evasion of apoptosis and induces non-response to antiproliferative signals [29]. The tissue’s microenvironment is fundamental to the shape, function, development and growth of tissue [30-31]. Taking into account the importance of cell-cell and cell-ECM interactions, three-dimensional cell cultures (3D) are an essential tool in cell development and cancer biology. In addition, they have become a valid alternative to the use of animal models, because they mimic in vivo conditions through a controlled and reproducible microenvironment [32]. 2. AIMS 1. Identify the proportion of CSCs in three BC tumor lines (MCF-7, MDA-MB-231 and SK-BR-3) after administration of different doses of radiation (0, 2 and 6 Gy). 2. Quantify the different secreted proteins (MMPs, TIMPs and HDACs) in different cell subpopulations (including that of CSCs), after the administration of different doses of radiation (0, 2 and 6 Gy) in the three tumor lines of BC. 3. Check the modifications, if any, after irradiation of MMPs, TIMPs and HDACs between in vitro (experimental) and in vivo studies (mice and patients). 4. To examine the behavior of MMPs, TIMPs and HDACs after radiation to be able to study them as possible predictive and prognostic biomarkers in BC, due to their relation in the invasion and tumor metastasis. 3. MATERIAL AND METHODS In this Doctoral Thesis, several in vitro studies were carried out with three tumor lines of human BC (MCF-7, MDA-MB-231 and SK-BR-3) and a human adult fibroblast cell line (HAF) derived of skin. The tumor lines were cultured in 2D (monolayer) and 3D (suspension) and 24 hours after being irradiated at 0, 2 and 6 Gy, the specific markers of breast CSCs (BCSCs) were determined: ALDH1, CD44+ y CD24-/low. The three tumor lines were also separated by flow cytometry in different cell subpopulations (general, positive or CSCs, and negative or non-CSCs), which were cultured in 3D and 3D+lrECM (Matrigel) and after 24 hours of irradiation at 0 , 2 and 6 Gy, the gene expression of MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, HDAC-1, HDAC-2 and HDAC-4 was determined by qRT-PCR. In addition, the tumor lines were co-cultured in Matrigel with HAF and 24 hours after being irradiated at 0, 2 and 6 Gy, the expression of the genes mentioned above was determined. In this investigation, an in vivo study on mice and a pilot study in BC patients were also carried out. The study on mice consisted in the monitoring of tumor growth after orthotopic inoculation in Matrigel of the three cell subpopulations (general, positive or CSCs, and negative or non-CSCs) of the MDA-MB-231 line, after having been irradiated to 0, 2 and 6 Gy. The tumors obtained were immersed in paraffin and cut into sections, in which a Hematoxylin-Eosin stain (H&E) and an immunohistochemical (IHC) stain of MMP-1 were performed. The pilot study consisted in the protein determination of MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-12, MMP-13, TIMP-1, TIMP -2, TIMP-3 and TIMP-4 by immunoassay, in 3 patient serum samples obtained at different times of treatment (before, during and after). The serum levels of these proteins were also studied according to different variables (dependent on the patients, dependent on tumor biology and related to RT) and according to the recurrence of the patients at 6 months after the end of treatment. 4. RESULTS AND DISCUSSION In the determination of specific markers of BCSCs (ALDH1, CD44+ y CD24-/low) after radiation, we saw that the expression of said markers varied depending on the culture model used. In general terms, the level of expression of ALDH1 decreased with radiation in both culture models in the three tumor lines. However, the expression of CD44+ increased with radiation in the 3D culture, which contained the positive subpopulation, that is, the subpopulation of CSCs. This marker has been associated with EMT [33] and with a poor prognosis in BC and, moreover, it is involved in resistance to RT and chemotherapy in several types of cancer [34-36]. In the measurements of gene expression in 3D cultures and 3D+lrECM after radiation, each tumor line expressed different genes. Our results showed that with the radiation the expression levels of MMP-1 and MMP-3 increased in the positive subpopulation (CSCs) in the MDA-MB-231 line in both culture models, with higher levels in cells grown in 3D+lrECM. Therefore, we suggest that this culture model could contribute to the appearance of a more aggressive MDA-MB-231 phenotype after radiation. In addition, the levels of MMP-9 and MMP-13 were also highlighted in the same tumor line in 3D culture. MMP-9 is one of the main orchestrators of ECM remodelling [22, 37], and MMP-13 is involved in tumor growth by regulating the activity and bioavailability of the growth factors sequestered in the ECM [38]. Regarding the HDACs, we have found that the alterations produced by radiation may depend on the dose administered and the cell subpopulation studied; which could alter the regulation they exert on the MMPs after said radiation. Regarding the TIMPs, we generally saw an increase in the expression levels of TIMP-1 in the 3D+lrECM culture, and of TIMP-2 in the 3D culture, showing statistical significance when comparing the cell subpopulations. In the determination of gene expression in co-cultures in Matrigel after radiation, the same genes were detected in the three tumor lines. Our results showed a significant increase in the expression of most of the genes at the dose of 6 Gy in the three tumor lines, but mainly, in the tumor line MDA-MB-231. In the monitoring of tumor growth in mice, we could see that this growth depends not only on the dose of radiation but also on the cell subpopulation studied. The highest volume tumor was obtained in the general subpopulation, which contains both CSCs and non-CSCs. We also saw that the tumors derived from cells irradiated at 2 Gy in the general and positive subpopulations, both containing the fraction of CSCs, have presented a larger volume with respect to the non-irradiated control. This would support the idea that the dose of 2 Gy would be insufficient to eradicate CSCs due to the radioresistance they present, and that this dose would also be able to promote tumor growth. This effect was more pronounced in the tumors corresponding to the general subpopulation, which suggests the importance of interactions between CSCs and non-CSCs in tumor proliferation after radiation. However, higher doses of radiation (6 Gy) are associated with a delay in tumor growth, probably due to the death of CSCs. These results would support the clinical relevance of hypofractionated regimens in BC. In the determination of the serum levels of MMPs in BC patients throughout the RT, we found a positive correlation between them before, during and after the RT, becoming stronger with radiation. In the temporary course of treatment, most of the MMPs analyzed increased non-significantly, highlighting the levels of MMP-2 and MMP-9. With respect to TIMPs, we found positive and negative correlations between their serum levels according to the time of RT, with an increase in negative correlations for TIMP-1 and TIMP-3 with radiation. Throughout the treatment, the serum levels of TIMP-1 and TIMP-3 decreased, which could be associated with the increase of some MMPs studied in this work. Regarding the variables studied, we found significant values in the correlations between MMP-3 serum levels and the menopausal state, the tumor classification, the degree of differentiation and the presence of E-cadherin; and between MMP-9 serum levels and the radiotoxicity. In contrast, among the TIMPs we found significant values in the correlations between TIMP-3 serum levels and the RT of the lymph nodes and the radioresistance; and between TIMP-4 serum levels and the presence of E-cadherin, the percentage Ki67 and the involvement of the sentinel node. Finally, when comparing serum protein levels according to tumor recurrence 6 months after treatment, we obtained an increase in most MMPs and TIMPs after RT in patients with tumor recurrence. These variations were not statistically significant, but they would be supporting the influence of MMPs in the development of carcinogenesis and its relationship with a poor prognosis in BC. 5. CONCLUSIONS 1. The expression of the BCSCs markers (ALDH1, CD44+ and CD24-/low) varies with the dose of radiation administered. In the positive subpopulation (CSCs), high doses of radiation (6 Gy) increases CD44+, which is associated with EMT and a poor prognosis in BC. 2. In the in vitro 3D and 3D+lrECM studies, the expression of MMPs, TIMPs and HDACs varies depending on the tumor line (MCF-7, MDA-MB-231 and SK-BR-3), the radiation dose (0, 2 and 6 Gy), the cell subpopulation (general, positive or CSCs, and negative or non-CSCs) and the 3D culture model (spheres suspended or embedded in Matrigel). 3. After cell irradiation and in both 3D culture models, MMP-1 increases its expression in the positive subpopulation (CSCs) of the MDA-MB-231 triple negative line, which is the most resistant. This fact suggests the importance of MMP-1 in the process of invasion and metástasis after radiation treatment. 4. The tumor microenvironment is also altered after radiation treatment, affecting the expression of MMPs, TIMPs and HDACs. 5. In the in vitro co-culture study (tumor lines with fibroblasts), in general, most of the genes studied increase their expression at high doses of radiation. This behavior supports the importance of the components of the tumor’s microenvironment (including fibroblasts) in the progression of the disease. 6. In the in vivo study, tumors formed from MDA-MB-231 cells irradiated at 2 Gy prior to inoculation have been of higher volume with respect to the control in the general and positive subpopulations. This fact shows that low doses of radiation would be insufficient to eradicate CSCs due to their radioresistance, contributing to tumor growth. 7. In tumor development in vivo, tumors formed from MDA-MB-231 cells irradiated at 6 Gy prior to inoculation dose have been the smallest within each cell subpopulation. This result suggests that at high doses of radiation (6 Gy) the tumor growth rate and the final volume of the tumor are reduced. 8. The pilot study carried out in BC patients shows that RT induces alterations in the serum levels of MMPs and TIMPs. 9. BC patients with tumor recurrence show an increase in serum levels of all MMPs analyzed and a decrease in TIMP-1 levels. This fact supports the theory that TIMP-1 is the main inhibitor of MMPs and the most related to them. The sample size is small and additional studies are required. 10. Finally, the results obtained in this work confirm the importance of the microenvironment and its components, and of the CSCs in tumor development and in the response to radiation treatment. 6. BIBLIOGRAPHY 1. Organizadión Mundial de la Salud. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/cancer. 2. Global Cancer Observatory. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.uicc.org/new-global-cancer-data-globocan-2018. 3. American Cancer Society. Fecha de acceso: 21 Mayo 2019. Disponible online: https://www.cancer.org/cancer/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/types-of-breast-cancer.html 4. Hendry JH. 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