Exploring the role of the haemoglobin from Bradyrhizobium diazoefficiens in nitric oxide detoxification during free-living and endosymbiotic lifestyles

Resumen

El óxido nítrico (NO) es un gas diatómico, formado por un átomo de oxígeno y otro de nitrógeno, con un electrón desapareado que lo convierte en un radical (Bartberger et al., 2002). El NO puede reaccionar con diferentes especies de oxígeno para formar las especies reactivas de nitrógeno (RNS) (Earnshaw y Greenwood, 1997). El NO está presente en todos los organismos vivos, donde puede actuar de forma diferente dependiendo de su concentración. A bajas concentraciones (niveles nmolares) el NO actúa como molécula señal, mientras que a concentraciones más altas (niveles µmolares) posee un efecto tóxico (Toledo y Augusto, 2012). En bacterias existen múltiples fuentes de NO, siendo la desnitrificación y la reducción desasimilativa de nitrato a amonio (DNRA) las principales fuentes respiratorias de NO (revisado en Torres et al., 2016). Además, debido al efecto tóxico del NO, las bacterias presentan diferentes sistemas y enzimas para su eliminación. Entre estos sistemas se encuentran las hemoglobinas, que son las proteínas mejor estudiadas y más importantes para la destoxificación aeróbica de NO en bacterias. En procariotas se han identificado tres tipos de hemoglobinas: flavohemoglobinas (fHb), hemoglobinas de dominio único (sdHb) y hemoglobinas truncadas (tHb) (revisado en Poole, 2005; Stern y Zhu, 2014; Gell, 2018). Bradyrhizobium diazoefficiens es una α-proteobacteria, Gram-negativa, perteneciente al orden Rhizobiales. Esta bacteria es capaz de crecer en condiciones limitantes de oxígeno empleando el nitrato como única fuente de nitrógeno, para asimilarlo y/o para respirarlo actuando como aceptor final de electrones. En esta bacteria, la respiración de nitrato constituye la primera etapa del proceso de desnitrificación. Además, B. diazoefficiens es un diazótrofo que establece asociaciones simbióticas con plantas de soja (Glycine max). Esta asociación simbiótica tiene lugar en los nódulos, que son unas estructuras especializadas de la raíz de la planta. En los nódulos, las formas diferenciadas del rizobio, los bacteroides, son los responsables de fijar el N2 atmosférico mediante la actuación de la enzima nitrogenasa. B. diazoefficiens, además de fijar N2 en simbiosis, también es capaz de llevar a cabo el proceso de desnitrificación, tanto en vida libre como en los nódulos de soja. En esta bacteria, las reacciones de desnitrificación son catalizadas por las enzimas nitrato reductasa periplásmica (Nap), nitrito reductasa (NirK), óxido nítrico reductasa (Nor) y óxido nitroso reductasa (Nos), que reducen el nitrato hasta N2 mediante la formación de NO y óxido nitroso (N2O) como intermediarios gaseosos. Estas enzimas están codificadas por los genes napEDABC (Delgado et al., 2003), nirK (Velasco et al., 2001), norCBQD (Mesa et al., 2002) y nosRZDYFLX (Velasco et al., 2004), respectivamente (revisado en Bedmar et al., 2005, 2013). Estudios previos, realizados en el Grupo del Metabolismo del Nitrógeno del Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos de la Estación Experimental del Zaidín (Granada), demostraron que la hipoxia y el nitrato inducen la formación de NO en nódulos de soja, siendo la desnitrificación en los bacteroides el principal proceso implicado en su formación. En este contexto, es preciso la existencia en el nódulo de mecanismos de destoxificación de NO, ya que se ha demostrado que el NO inhibe la actividad nitrogenasa, así como la expresión del gen nifH, responsable de su síntesis. En este sentido, se ha propuesto a la enzima desnitrificante Nor como la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja (Sánchez et al., 2010). Además de desnitrificar, B. diazoeficciens es capaz de asimilar nitrato en vida libre mediante la expresión de un sistema coordinado de asimilación de nitrato y destoxificación de NO, codificado por el operón narK-bjgb-flp-nasC. Este operón es responsable de la síntesis de un transportador de nitrato/nitrito (NarK), una hemoglobina (Bjgb), una flavoproteína dependiente de NAD(P)H (Flp) y una nitrato reductasa asimilativa (NasC). Cerca de estos genes se encuentra otro operón que incluye genes que codifican para una nitrito reductasa asimilativa (NirA) y un sistema regulador de respuesta a nitrato/nitrito (NasST). Estudios previos han demostrado que Bjgb es una hemoglobina de dominio único implicada en la destoxificación de NO en células cultivadas en vida libre (Cabrera et al., 2016). En esta Tesis Doctoral, se ha demostrado el papel in vitro de la hemoglobina Bjgb y la flavoproteína Flp de B. diazoefficiens en el metabolismo del NO. Con este objetivo, se han clonado los genes bjgb y flp de B. diazoefficiens en plásmidos de expresión para posteriormente sobre-expresar y purificar las proteínas Bjgb y Flp. Una vez purificadas dichas proteínas, se ha realizado un estudio in vitro de las mismas mediante espectroscopía UV-Vis. Se ha confirmado la capacidad de la flavoproteína Flp de recibir electrones del NADH y de reducir a la hemoglobina de dominio único Bjgb. Una vez reducida la Bjgb, se ha demostrado que el grupo hemo de esta proteína es capaz de unir NO. Con estos resultados se ha demostrado la capacidad de Bjgb de unir NO in vitro, lo cual confirmaría el papel de esta proteína de destoxificar NO in vivo. Además, se ha estudiado el papel de la lisina 52 de la Bjgb de B. diazoefficiens. Para ello, se ha realizado una mutación puntual mediante QuickChange de esta lisina por una alanina (K52A Bjgb). El análisis de la función in vivo de esta mutante se ha llevado a cabo mediante la complementación de la mutante bjgb de B. diazoefficiens con dos plásmidos, uno que sobre-expresa la proteína nativa Bjgb y otro que sobre-expresa la proteína mutante K52A Bjgb. La reducción de la expresión del promotor del gen norC, responsable de la síntesis de la enzima óxido nítrico reductasa, fue superior en la mutante bjgb que sobre-expresaba la Bjgb que en la mutante bjgb que sobre-expresaba la K52A Bjgb, cada una de ellas comparadas con la cepa mutante bjgb. Estos resultados se han verificado al medir niveles muy bajos, apenas detectables, de proteína NorC y de producción de N2O en la mutante bjgb que sobre-expresaba la Bjgb. Mientras que en la mutante bjgb que sobre-expresaba la K52A Bjgb se detectaron niveles de proteína NorC y de producción de N2O inferiores a los observados en la mutante bjgb. Estos resultados han demostrado que la lisina 52 de la Bjgb tiene un papel importante en homeostasis de NO in vivo. En esta Tesis Doctoral, también se ha abordado el estudio de la implicación de la Bjgb de B. diazoefficiens en la interacción simbiótica con plantas de soja y en la homeostasis de NO en nódulos de soja. Mediante la técnica de la dilución isotópica del 15N y análisis de la actividad y expresión de la enzima nitrogenasa, se ha demostrado que las plantas de soja inoculadas con la cepa mutante en la hemoglobina tienen mayor tolerancia al encharcamiento que aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Este efecto beneficioso se debe a la reducción de la acumulación de NO en los nódulos producidos por plantas de soja inoculadas con la cepa mutante en la hemoglobina y sometidas a encharcamiento, en comparación con los nódulos encharcados de la cepa parental. Esta disminución en la acumulación de NO podría ser debida a la inducción de la expresión y actividad de la enzima óxido nítrico reductasa (Nor), la cual es la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja. Por último, se ha estudiado la implicación en simbiosis del proceso de asimilación de nitrato. Para ello, se han utilizado las mutantes en los genes nasC y nirA, responsables de la síntesis de la nitrato reductasa y nitrito reductasa asimilativa, respectivamente. Mediante el análisis de la actividad nitrogenasa y contenido en leghemoglobina de los nódulos de soja, se ha demostrado que la inoculación de las plantas de soja con una cepa mutante nirA confiere protección de la fijación biológica de nitrógeno frente al encharcamiento, en comparación con aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Sin embargo, en las plantas inoculadas con la cepa mutante nasC y sometidas a encharcamiento no se observaron diferencias significativas en la fijación biológica de nitrógeno en comparación con aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Estos resultados, junto con el análisis de la actividad nitrato reductasa en bacteroides, han puesto de manifiesto que la principal enzima implicada en la reducción de nitrato en los bacteroides de nódulos de soja es la nitrato reductasa periplásmica (NapA). Con el objeto de profundizar en el posible papel de la asimilación de nitrato por los bacteroides en nódulos de soja, se ha utilizado una cepa de B. diazoeficciens mutante en el gen nifH, responsable de la síntesis de la Fe-proteína del complejo nitrogenasa. El análisis de la expresión del gen narK, el primer gen del operón que codifica para las enzimas implicadas en la asimilación de nitrato, demostró una significativa inducción de su expresión en nódulos de una cepa mutante nifH en relación con los niveles de expresión observados en los nódulos producidos por la cepa parental. Estos resultados se confirmaron mediante la detección de un incremento en el contenido en amonio de los nódulos de la cepa mutante nifH aislados de plantas cultivadas con nitrato, en comparación con los cosechados de plantas crecidas en ausencia de nitrato, donde no se detectó producción de amonio en los bacteroides. Por tanto, estos resultados sugieren que la asimilación de nitrato por los bacteroides podría tener una función relevante en nódulos de soja en aquellos casos en los que la fijación de nitrógeno esté dañada. Los resultados obtenidos durante esta Tesis Doctoral han contribuido a incrementar el conocimiento sobre la función in vivo e in vitro de la proteína Bjgb de B. diazoefficiens en la destoxificación de NO, tanto en vida libre como en asociación simbiótica con plantas de soja. Además, se ha establecido el posible papel de las proteínas NasC y NirA de B. diazoefficiens en la asimilación de nitrato y nitrito en nódulos de soja.