The Reverse Transcriptases associated with CRISPR-Cas systemsPhylogenetic relationships and functional characterization

Resumen

El objetivo planteado en esta tesis doctoral consistió en la caracterización de nuevos grupos de RTs haciendo especial hincapié en aquellos asociados a los sistemas CRISPR-Cas. Un primer análisis de la distribución diferencial de estas enzimas entre bacterias y arqueas reveló que determinados grupos de procariotas han reclutado ciertos tipos de RTs para mejorar su respuesta a las condiciones ambientales de su nicho ecológico. Posteriormente, el análisis se focalizó en las RTs asociadas a los sistemas CRISPR-Cas clasificándolos en 15 clados filogenéticos con al menos tres orígenes evolutivos diferentes apoyando un modelo de “múltiples orígenes” para esta asociación. Estas RTs se pueden encontrar solas, fusionadas en su extremo Cterminal a un dominio Cas1 (RTCas1) o formando parte de una proteína multidominio (Cas6RTCas1). Además, la mayoría de estas enzimas forman parte de sistemas CRISPR-Cas de tipo III, aunque también existen ejemplos minoritarios asociados a tipo I-A y a tipo VI. Para la caracterización funcional de los sistemas CRISPR-Cas que contienen RTs, primero se determinó la actividad RT exógena in vitro de diversos candidatos, centrando finalmente el estudió en dos sistemas: el operón adaptativo de la Cianobacteria Scytonema hofmanni PCC 7110, que contiene una RT sin fusionar, y el de la Proteobacteria Vibrio vulnificus YJ016, que presenta una fusión RTCas1. En ambos sistemas, la purificación de las distintas proteínas pertenecientes al operón adaptativo ha permitido estudiar su interacción, demostrando como resultado más relevante que las proteínas Cas2A y Cas2B del sistema de V. vulnificus forman un complejo heterodimérico estable. Ensayos in vivo demostraron que el operón adaptativo (RTCas1-Cas2A-Cas2B) de V. vulnificus YJ016 es capaz de adquirir espaciadores en un hospedador heterólogo (E. coli) en un proceso que requiere la presencia de las dos Cas2. Además, la adquisición se reduce drásticamente mediante mutaciones en el sitio activo de la RT. También se verificó que este sistema es capaz de adquirir espaciadores directamente de moléculas de ARN. Por otro lado, el análisis de los espaciadores adquiridos y de su secuencia reveló características particulares que podrían estar relacionadas con su reconocimiento específico por parte del operón adaptativo. Finalmente, ensayos en el hospedador natural han revelado que el módulo interferente de este sistema CRISPR-Cas de tipo III-D es activo, requiriendo para ello la transcripción de su ADN diana