Adaptación de rizobios y bacterias solubilizadoras de fosfato a condiciones salino-alcalinas para el desarrollo de biofertilizantes eficientes para Lotus tenuis e identificación de genes bacterianos implicados en la tolerancia a dicha condición

Resumen

La región de la Pampa Deprimida del Salado (PDS) concentra la mitad del stock de bovino de la provincia de Buenos Aires y se considera la región de cría más importante de la Argentina. No obstante, aproximadamente el 60% de superficie de esta región está dominada por “suelos bajos” cuyas características edáficas limitan severamente la producción de pasturas de calidad. En ese contexto, hay un profundo interés por la búsqueda de alternativas que posibiliten un mejor aprovechamiento de estos suelos bajos, con el objetivo de incrementar el recurso forrajero y subsecuentemente, la productividad ganadera. Entre las estrategias propuestas, el uso de leguminosas nativas o naturalizadas como Lotus tenuis es una de las más destacadas. Esta leguminosa es muy atractiva por su altísimo valor forrajero y por su adaptación a los diferentes ambientes de la PDS, incluso a aquellos que representan las zonas más restrictivas como los bajos alcalino-sódicos. No obstante, la incorporación exitosa a estos últimos está todavía lejos de ser óptima. En respuesta a esta problemática, en este trabajo de tesis se propuso la búsqueda de bacterias promotoras de crecimiento vegetal asociadas a L. tenuis, tolerantes a condiciones salino-alcalinas, para el diseño de bio-formulados como estrategia de mejora para la producción de pasturas en la Pampa Deprimida del Salado. Para ello, como tema central, se analizaron dos comunidades de bacterias: bacterias solubilizadoras de fosfato (BSF) y bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN). Se analizó una población de 310 bacterias solubilizadoras de fosfato aisladas de la rizosfera de plantas de L. tenuis naturalizadas en los suelos bajos alcalino-sódicos de la Pampa Deprimida del Salado, de la cual más del 95% mostró la capacidad de solubilizar fosfato bajo condiciones salino-alcalinas. De acuerdo a ello, los aislamientos se cualificaron en 3 grupos fenotípicos, siendo el grupo de bacterias con capacidad solubilizadora de fosfato de rango amplio (BSFRA) el más promisorio, por su plasticidad para solubilizar fosfato en diferentes condiciones alcalino-sódicas. Este grupo resultó ser muy diverso genéticamente, además de estar compuesto exclusivamente por miembros de la familia Pseudomonadaceae y del orden Enterobacteriales (este último el más dominante), pertenecientes a al menos 7 géneros bacterianos. El género Pantoea fue uno de los más abundante con 9 cepas genéticamente diferentes. En base a sus antecedentes en la promoción del crecimiento vegetal y al criterio de “uso de microorganismos seguros” se selecionaron las cepas de P. eucalypti MA66, P76, P63, P163 y P173 para estudios comparativos tanto in vitro como en planta. Todas las cepas de P. eucalypti mostraron atributos PGPR in vitro evidenciando su potencial efecto promotor en plantas. No obstante, cuando fueron evaluadas en el sistema tripartito Rizobio-PGPR-leguminosa en suelos alcalino-sódicos, mostraron efectos diferenciales notables en las variables de crecimiento peso seco total, peso seco de vástago y peso seco de nódulos, así como en la concentración y acumulación de P, N y Zn. Estos resultados revelaron la fuerte variabilidad intra-especie y la complejidad de las interacciones planta-microorganismo, además de la importancia de la evaluación in planta para la selección de cepas promisorias para la elaboración de bioformulados. Simultáneamente se realizó otro análisis de prospección de la comunidad de rizobios simbiontes asociados a L. tenuis. Con ese fin se analizó una comunidad de 126 rizobios infectivos que reveló ser genéticamente muy diversa, además de estar dominada –aunque no exclusivamentepor miembros del género Mesorhizobium; otros miembros de la familia Phyllobacteriaceae (Aminobacter y Phyllobacterium) también fueron identificados. Mediante la caracterización de la tolerancia a condiciones salinas y/o alcalinas, se determinó que la comunidad de simbiontes infectivos es mayoritariamente sensible a estas condiciones in vitro. El mismo patrón de comportamiento se observó en un sistema in vivo con suelo proveniente de los bajos alcalino-sódicos, aunque este último no fue tan restrictivo como el primero. La comparación de los resultados obtenidos en ambos sistemas evidenció la complejidad de los mecanismos de adaptación de los rizobios frente al estrés abiótico del medio. De toda la comunidad de rizobios infectivos se identificó a las cepas del género Aminobacter como las más destacadas en cuanto a sus capacidades de adaptación a las condiciones salino-alcalinas in vitro y en suelo. En base a estos resultados, se utilizó un rizobio del género Aminobacter tolerante a condiciones alcalino-sódicas para profundizar el conocimiento acerca de sus mecanismos de tolerancia. Se seleccionó a la cepa Aminobacter sp. BA135 como organismo de estudio para la identificación de los mecanismos de tolerancia a las condiciones salino-alcalinas. Mediante mutagénesis aleatoria se identificaron dos grupos de genes involucrados en la respuesta a salinidad o a salinidad y alcalinidad en simultáneo. Mientras que entre las estrategias de respuesta a salinidad se hallaron la modificación de la estructura de la pared bacteriana, el uso de osmolitos compatibles y el control del estrés oxidativo, frente al estrés salino-alcalino, se identificó como principal estrategia de respuesta la regulación de la homeostasis, seguido de la modulación del metabolismo de pared bacteriana también y la activación de genes de respuesta al estrés. Además, se identificó la cobalamina (vitamina B12) como molécula importante para la tolerancia a estrés alcalino-salino. De manera complementaria, un estudio transcriptómico abundó en el hecho de que BA135 emplea una variedad de estrategias complejas y coordinadas con el fin de mantener las funciones centrales y asegurar la viabilidad celular, que incluyen la regulación de la homeostasis, almacenamiento de fuentes de carbono, control de los niveles de especies reactivas al oxígeno (ROS), cambios de expresión en los sistemas de transporte de sustratos, optimización de los recursos energéticos, expresión de genes de respuesta al estrés y la acumulación de osmoprotectores. Este estudio reveló también una interesante conexión entre la síntesis de metionina dependiente de cobalamina y el metabolismo del soluto compatible glicina-betaína en condiciones de estrés. Los resultados de esta tesis ponen de manifiesto la composición de las comunidades de BSF y BFN asociadas a L. tenuis y su potencial para promover el crecimiento y la nutrición mineral en L. tenuis cuando se utilizan consorcios compatibles, así como los múltiples mecanismos de tolerancia frente al estrés salino-alcalino por parte del rizobio Aminobacter sp. BA135, que pueden aportar a mejorar la sobrevida de los microorganismos formulados en los bioinsumos en ambientes restrictivos como los bajos alcalinos-sódicos.