Desarrollo de herramientas fisiológicas y genómicas para mejorar la calidad postcosecha del fruto de calabacín

Resumen

El calabacín (Cucurbita pepo L.) es uno de los cultivos hortícolas de mayor importancia en España, especialmente en el sudeste andaluz. La mayor parte de la producción se destina a la exportación, lo que hace necesario una adecuada conservación postcosecha del fruto para mantener su calidad hasta su llegada al consumidor. El origen subtropical de este fruto lo hace susceptible de desarrollar daños por frío (DF) si se mantiene en un ambiente a baja temperatura, por encima del punto de congelación, hecho que ocurre de manera general durante su almacenamiento y transporte a los mercados de destino. Además, el calabacín es un fruto que se cosecha en estado inmaduro, siendo más propenso a sufrir estos daños que se traducen en una pérdida de peso, ablandamiento y aparición de hundimientos en el exocarpo (pitting), resultado de las numerosas alteraciones fisiológicas y bioquímicas que ocurren en sus tejidos. Estos daños por frío producen el deterioro de la calidad del fruto dando, por tanto, lugar a graves pérdidas económicas. Para evitar estas pérdidas es necesario por un lado buenos programas de mejora que desarrollen nuevas variedades con frutos más resistentes, así como el desarrollo de técnicas que sean capaces de mejorar la vida útil de los frutos de las variedades existentes en el mercado. A su vez, poner a punto un protocolo de regeneración y editado genético en C. pepo es de vital importancia ya que podría suponer el uso de plantas transgénicas de este cultivo para avanzar en la obtención de resistencia o tolerancia a la frigoconservación. En esta Tesis se ha avanzado en el uso de técnicas de mejora de la vida útil del fruto de C. pepo, ya que se han realizado dos tratamientos químicos que han mejorado la conservación en frío de frutos sensibles a este estrés, uno de ácido abscísico (ABA) y otro de óxido nítrico (NO). También se ha trabajado en la puesta a punto de un protocolo de regeneración de plantas de C. pepo mediante cultivos in vitro de secciones de cotiledón, con el objetivo de utilizar estos protocolos para una posterior puesta a punto de un sistema de transformación y editado genético en esta especie. El uso de un vector vírico para expresión de genes en calabacín ha sido un abordaje paralelo al sistema de transformación que se ha implementado también en esta Tesis y que puede servir para estudios de expresión transitoria en esta especie. Asimismo, se ha caracterizado un gen que codifica un factor de transcripción que parece ser un buen candidato como activador de tolerancia al frío. Los tratamientos de ABA y NO se han realizado en las variedades comerciales Natura y Sinatra, la primera es una variedad cuyo fruto resiste bien las bajas temperaturas, mientras que los frutos de Sinatra son muy sensibles a la conservación en frío. Con respecto al ácido abscísico, se ha podido comprobar la importancia de esta hormona en la resistencia de los frutos a las bajas temperaturas postcosecha, ya que los tratamientos con ABA en frutos sensibles al frío mejoraban notablemente la vida útil de los mismos, mientras que en la variedad Natura, tolerante, el uso de un inhibidor de ABA generó sensibilidad en frutos resistentes. En frutos tolerantes se detectó un incremento en los niveles de ABA endógenos que no estaba presente en frutos de la variedad sensible. Este incremento iba acompañado de una mayor transcripción de genes implicados en la vía de señalización de ABA. Los niveles de ABA en fruto mostraron una significativa correlación negativa con la pérdida de peso y los daños por frío. El NO es una molécula que se ha relacionado con procesos de estrés en otras especies. El tratamiento postcosecha de frutos con NO se llevó a cabo mediante la aplicación de nitroprusiato de sodio (SNP), donador de NO. La aplicación de SNP mejoró la calidad del fruto de calabacín almacenado a baja temperatura, observándose una reducción de la pérdida de peso, daños por frío, fuga de electrolitos, contenido de malondialdehído y H2O2, y el aumento de algunas actividades enzimáticas importantes en la respuesta al estrés. La efectividad del tratamiento se pudo determinar mediante la detección de las proteínas S-nitrosiladas, que fueron más abundantes en el exocarpo de los frutos a los que se aplicó NO. El tratamiento con NO tuvo un papel regulador en el equilibrio antioxidante del fruto de calabacín, prolongando así la calidad del mismo durante la conservación en frío. En la actualidad las herramientas biotecnológicas permiten un mayor conocimiento del genoma, el estudio de la función génica y la selección de marcadores para su uso en técnicas de mejora vegetal, así como la posibilidad de generar nuevas variedades mediante el uso de plantas transgénicas. Nuestro grupo de investigación ha seleccionado, mediante estudios transcriptómicos, una serie de genes candidatos implicados en la tolerancia al frío entre los que destaca el gen MYB106-like. Para validar estos datos y realizar la caracterización de este gen se realizaron una serie de estudios de expresión y análisis in silico. La expresión del gen en fruto de la variedad tolerante aumentó drásticamente con el almacenamiento en frío. En hojas y meristemos la expresión fue muy baja y se no pudo establecer una relación de la expresión con la tolerancia al estrés por frío en estos tejidos. En cuanto a las estrategias biotecnológicas relacionadas con la modificación de la expresión de genes de interés, debido a la dificultad que ha mostrado esta especie a la transformación y a la resistencia de la opinión pública al uso de tecnologías con organismos modificados genéticamente, se optó en primer lugar por la utilización de vectores víricos para la sobreexpresión y silenciamiento de genes en calabacín, siendo MYB106-like el gen seleccionado para estos estudios. El vector ZYMV-AGII atenuado fue el utilizado, para la evaluación de los efectos causados por la infección en la planta y en última instancia, en el fruto. Las construcciones víricas provocaron un fenotipo de infección no uniforme de la planta. Se detectó en hojas tanto la sobreexpresión como el silenciamiento del gen candidato utilizado (MYB106-like). En frutos infectados con vector vírico para la sobreexpresión, se detectó la presencia del virus y el aumento de la expresión del gen en todos los tejidos analizados, aunque el fenotipo no mostró diferencias con el control. Pese a los resultados positivos y las ventajas de esta técnica frente a otras, también presenta limitaciones para su utilización en el estudio de la postcosecha del fruto. No obstante, puede ser muy útil para los ensayos de expresión en plántulas. Debido a las limitaciones encontradas en las técnicas con vectores víricos y para establecer técnicas que permitan generar líneas transformadas estables, en la presente Tesis Doctoral se ha trabajado en la puesta a punto de protocolos de regeneración y transformación genética en C. pepo. Para ello, en primer lugar, se ha trabajado en la selección de explantes y en la optimización de medios de cultivo para la regeneración de plantas de C. pepo, utilizando diferentes variedades de esta especie. De los resultados de los análisis se seleccionaron medios de cultivo para la regeneración que alcanzaron hasta un 40 % de inducción de brote y casi un 90 % de raíz a partir de explantes de cotiledón conteniendo una fracción de hipocótilo. Una vez puesto a punto el sistema de regeneración, se ha trabajado en la transformación utilizando distintas cepas de Agrobacterium transformadas con el plásmido pGFPGUSplus como vector control. Se han obtenido resultados que optimizan el proceso, aunque no son definitivos. De entre las distintas cepas usadas, AGL0 fue la que proporcionó mejores resultados, llegando a representar hasta un 16 % de los grupos de células transformadas en los explantes. Zucchini (Cucurbita pepo L.) is one of the most important horticultural crops in Spain, especially in the southeast of Andalusia. Most of the production is destined for export, which makes proper postharvest storage of the fruit necessary to maintain its quality until it reaches the consumer. The subtropical origin of this fruit makes it susceptible to developing chilling injuries (CI) if it is kept at low temperature, above the freezing point, a fact that generally occurs during storage and transport to destination markets. Besides, zucchini fruit is harvested in an immature state, being more susceptible to suffer these damages resulting in weight loss, softening and the appearance of pitting in the exocarp surface, as a result of numerous physiological and biochemical alterations. These chilling injuries result in a decrease in fruit quality, and cause serious economic losses. To avoid these losses, it is necessary, on the one hand, good breeding programs to introduce new varieties with a more resistant fruit to chilling conditions, as well as the development of techniques capable of improving the fruit shelf life in the existing varieties. At the same time, the implementation of protocols for plant regeneration and genetic editing in C. pepo is of vital importance since it could involve the use of transgenic plants of this crop to advance in obtaining resistance or tolerance to cold storage. In this Thesis, progress has been made in the use of techniques to improve the useful life of C. pepo fruit, since two chemical treatments have been carried out that have improved the cold storage of sensitive fruit to this stress, one of abscisic acid (ABA) and another of nitric oxide (NO). Work has also been done on the development of a protocol for the plant regeneration of C. pepo using in vitro cultures of cotyledon sections, to use these protocols for subsequent development of a transformation and genetic editing system. The use of a viral vector for gene expression in zucchini has been a parallel approach to the transformation system that has also been implemented in this Thesis to be used for transient expression studies in this species. Likewise, a gene encoding a transcription factor that appears to be a good candidate as an activator of cold tolerance has been characterized. The ABA and NO treatments have been carried out on the commercial varieties Natura and Sinatra, being the former a cold tolerant variety, whereas Sinatra fruit are very sensitive to cold storage. From the experiments with abscisic acid, it has been possible to verify the importance of this hormone in the resistance of fruit to low storage temperatures, since ABA treatments in cold-sensitive fruit notably improved their shelf life, while in the tolerant variety Natura, the use of an ABA synthesis inhibitor induced cold sensitivity in the previously resistant fruit. In tolerant fruit, an increase in endogenous ABA levels was detected that was not present in fruit of the sensitive variety. This increment in ABA paralleled in an increase in transcription of genes involved in the ABA signalling pathway. The amount of ABA in fruit showed a significant negative correlation with weight loss and cold damage. The NO is a molecule that has been related to stress processes in other species. The pre-storage NO-treatment of fruit was carried out by applying sodium nitroprusside (SNP), a NO donor. The application of SNP improved the quality of the zucchini fruit stored at low temperature, detecting a reduction in weight loss, cold damage, electrolyte leakage, the content of malondialdehyde and H2O2, and induced the activity of several enzymes implicated in the response to stress. The effectiveness of the treatment could be determined by detecting the S-nitrosylated proteins, which were more abundant in the exocarp of the NO-treated fruit. The treatment with NO had a regulatory role in the antioxidant balance of the zucchini fruit, thus prolonging its quality during cold storage. Currently, the use of biotechnological tools in crop species allows a better knowledge of their genomes, permits the study of gene function and the selection of genetic markers to be used in plant breeding techniques, and opens the possibility of generating new varieties through the use of plant transformation. Our research group has selected, through transcriptomic studies, a series of candidate genes involved in cold tolerance, among which the MYB106-like gene stands out. To validate these data and perform the characterization of this gene, a series of expression studies and in silico analyzes were developed. The gene expression in the fruit of the tolerant variety increased dramatically with cold storage. In leaves and meristems, the expression was very low and it was not possible to establish a relationship between the levels of expression and tolerance to cold stress in these tissues. Regarding the biotechnological strategies related to the expression modification genes of interest, and due to the difficulty that this species has shown to transformation, added to the resistance of public opinion to the use of technologies with genetically modified organisms, the first choice was to use viral vectors for genes overexpression and silencing in zucchini. The gene MYB106-like was selected for these studies. The attenuated vector ZYMV-AGII was used for the evaluation of the effects caused by the infection in the plants and ultimately, in the fruit. The viral constructs elicited a non-uniform plant infection phenotype. Both overexpression and silencing of the candidate gene used (MYB106-like) were detected in leaves. In infected fruit with the overexpression viral vector, the presence of the virus and the increased expression of the gene were detected in all tissues analyzed, although the phenotype did not show differences with the control. Despite the positive results and the advantages of this technique over others, it also presents limitations for its use in the study of the postharvest fruit. However, it can be very useful for expression assays in seedlings and vegetative tissues. Due to the limitations found with the use of viral vectors and to establish techniques that allow the generation of stable transformed plant lines, in this Doctoral Thesis protocols for plant regeneration and genetic transformation in C. pepo have been set up. To do this, in the first place, we have worked on the selection of the suitable explants and on the optimization of culture media for the regeneration of C. pepo plants, using different varieties of this species. The culture media selected for regeneration achieved up to 40% shoot induction and almost 90% root induction from cotyledon explants containing a hypocotyl fraction. Once the regeneration system was implemented, the transformation was performed using different Agrobacterium strains harboring as a control vector the plasmid pGFPGUSplus. Among the different strains used, AGL0 was the one that provided the best results, representing up to 16% of the groups of transformed cells in the explants. Several results that optimize the system of transformation have been obtained, although more work is needed to stablish a good transformation protocol for C. pepo.