Análisis estructurales comprensivos de anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión terapéuticos . Aplicaciones en estudios de estabilidad en condiciones reales de uso hospitalario

Zusammenfassung

En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado y puesto a punto estrategias analíticas comprensivas para evaluar distintos atributos críticos de la calidad de proteínas terapéuticas comerciales de naturaleza biotecnológica: anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión-Fc, que posteriormente han sido empleadas en estudios de caracterización y estabilidad de las mismas en condiciones de uso hospitalario. Las proteínas estudiadas han sido: dos anticuerpos monoclonales, uno innovador u original, el infliximab, en su medicamento Remicade® (Janssen Biologics B.V), y otro biosimilar de este, el CT-P13, en dos medicamentos bioidénticos entre ellos, Inflectra™ (Pfizer Europe MA EEIG) y Remsima (Celltrion Healthcare Hungary Kft); y una proteína de fusión-Fc, el ziv-aflibercept, en su medicamento innovador Zaltrap® (Bayer AG). Estos medicamentos se encuentran entre los más usados a nivel mundial, y en particular, en los hospitales españoles, por lo que fueron seleccionados para llevar a cabo la investigación presentada en esta Tesis Doctoral. En el Capítulo I se ha establecido un perfil indicador de la estabilidad fisicoquímica y funcional del anticuerpo monoclonal infliximab (Remicade®, medicamento innovador) y de su biosimilar CT-P13 (Remsima™ e Inflectra™, medicamentos bioidénticos), haciendo uso de un conjunto de técnicas analíticas: cromatografía de exclusión molecular con detección ultravioleta acoplada a espectrometría de masas en modo nativo (SE/UHPLC-UV(native)MS(Orbitrap)), para estudiar el perfil de oligómeros y de isoformas en estado nativo; dispersión dinámica de la luz (DLS), para estudiar el particulado de las disoluciones; espectropolarimetría de dicroísmo circular (DC) en el UV lejano, para estudiar las estructuras secundarias, incluido el porcentaje presente de las mismas; espectroscopia de fluorescencia intrínseca de triptófanos, para estudiar la estructura terciaria, el plegamiento o desplegamiento de la proteína; cromatografía líquida en fase reversa con detección ultravioleta (RP/UHPLC-UV), para cuantificar las proteínas, y ELISA indirecto, para estudiar la funcionalidad. Esta metodología fue puesta a punto y validada sometiendo las disoluciones de los medicamentos a distintas condiciones de degradación acelerada y controlada como temperatura elevada, luz visible, ciclos de congelación/descongelación, dilución en medio hipertónico de NaCl y dilución en disolución desnaturalizante fuerte como control negativo (cloruro de guanidinio). Los objetivos de dicho estudio fueron comparar la estabilidad frente a la degradación y la estabilidad de disoluciones clínicas de los medicamentos, así como validar los propios métodos como indicadores de la estabilidad, al ser capaces de detectar las modificaciones provocadas en las proteínas y sus disoluciones. Los resultados del presente trabajo demostraron que infliximab y CT-P13 se degradan de manera muy similar, presentando ambos niveles similares en cuanto a formación de agregados, variación estructural, y modificaciones químicas. Las disoluciones clínicas de ambos anticuerpos monoclonales demostraron estabilidad fisicoquímica y funcional durante un periodo mínimo de 14 días (el periodo de tiempo estudiado), independientemente de la concentración: 10.0, 2.0 y 0.4 mg/mL, y el material de almacenamiento (viales de vidrio o bolsas de poliolefina). En el caso de los estudios mediante ELISA, la funcionalidad de infliximab y CT-P13 se mantuvo durante 60 días. En el capítulo II se muestran los resultados de un estudio conformacional comprensivo llevado a cabo en la proteína de fusión-Fc ziv-aflibercept (Zaltrap®, medicamento innovador). El objetivo aquí fue evaluar el impacto de la manipulación hospitalaria sobre su estabilidad fisicoquímica y funcional, además de la propia caracterización de la proteína, hecho en sí mismo de interés, ya que no hay prácticamente datos analíticos publicados sobre esta compleja proteína. Para ello, disoluciones del medicamento fueron sometidas a distintas condiciones de degradación acelerada y controlada como temperatura elevada, ciclos de congelación/descongelación, exposición a luz visible, variación del pH de la disolución, dilución en un medio hipertónico de NaCl y dilución en un medio desnaturalizante fuerte, empleado este como control negativo (cloruro de guanidinio). Posteriormente, se llevó a cabo una caracterización fisicoquímica y funcional, que ha permitido evaluar la formación de oligómeros y particulado (cromatografía de exclusión molecular con detección ultravioleta (SE/HPLC-DAD) y dispersión dinámica de la luz (DLS), detectar cambios en las estructuras secundarias y terciarias (espectropolarimetria de dicroísmo circular (DC) en el UV lejano y espectroscopia de fluorescencia intrínseca de triptófanos, así como detectar alteraciones en la funcionalidad (mediante ELISA indirecto). De esta investigación se extrae que la agregación es la vía de degradación más importante en esta proteína, habiéndose detectado en la mayor parte de las disoluciones sometidas a estreses controlados. Se han detectado dímeros (muestras sometidas a la acción de la luz visible) y agregados de alto peso molecular (detectados principalmente en las muestras sometidas a un aumento de la temperatura). A estos últimos se les ha atribuido estructuras de tipo β-amiloide, hecho que fue confirmado por técnicas complementarias como distintos ensayos de unión (ensayo de tioflavina T y Congo Red) y microscopia de transmisión de electrones (TEM, Transmision Electron Microscopy). Este tipo de estructura ha sido puesta de manifiesto por vez primera en este trabajo, y es distintiva de esta proteína de fusión, ya que no se ha detectado en otras proteínas terapéuticas basadas en IgG. En cuanto a las estructuras secundarias, estas se mantuvieron inalteradas salvo en las muestras sometidas a la acción del cloruro de guanidinio. Las estructuras terciarias se vieron afectadas en distinto grado (principalmente por aumento de la temperatura, exposición a la luz visible y acción del cloruro de guanidinio, salvo en las muestras sometidas a ciclos de congelación/descongelación. Por último, la funcionalidad se mantuvo en general, observándose sólo una disminución significativa en muestras estresadas por luz. En el capítulo III se muestran los resultados de un estudio de estabilidad en el tiempo de disoluciones clínicas de ziv-aflibercept (Zaltrap®, medicamento innovador). El objetivo fue evaluar la estabilidad fisicoquímica y funcional de disoluciones clínicas del mismo, preparadas y almacenadas en condiciones de uso hospitalario, esto es, en bolsas de poliolefina a las concentraciones intermedia (4mg/mL) y baja (0,6 mg/mL), que vienen indicadas en su correspondiente ficha técnica para ser administradas por vía intravenosa a los pacientes. El estudio de estabilidad se llevó a cabo en condiciones de oscuridad durante 14 días, almacenadas las muestras refrigeradas a 2-8ºC. En esta investigación, quedó demostrada la estabilidad fisicoquímica y funcional de dichas disoluciones durante el periodo de tiempo estudiado en cuanto a formación de oligómeros y particulado (mediante cromatografía de exclusión molecular con detección ultravioleta (SE/HPLC-DAD) y dispersión dinámica de la luz (DLS); cambios en las estructuras secundarias y terciarias (espectropolarimetria de dicroísmo circular (DC) en el UV lejano y espectroscopia de fluorescencia intrínseca de triptófanos); cambios en el perfil de variantes de carga (cromatografía líquida de intercambio catiónico fuerte con detección ultravioleta (SCX/UHPLC-UV), y funcionalidad (mediante evaluación de la actividad biológica por ELISA indirecto).