Molecular mechanisms underlying LRRK2-mediated centrosomal cohesion deficits as biomarker for Parkinson’s disease

Resumen

Las mutaciones en Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) son la causa más común de la enfermedad de Parkinson familiar con herencia autosómica dominante, y otras variantes en este gen aumentan el riesgo de sufrir la forma esporádica de la enfermedad. Se ha observado que LRRK2 participa en la regulación de varios eventos del tráfico intracelular de membranas, incluyendo el tráfico endocítico y endolisosomal, autofagia y tráfico retrógrado, así como participa en cascadas de señalización celular. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estos eventos aún no se conocen con exactitud. Recientemente, se ha revelado que LRRK2 fosforila un subconjunto de proteínas RAB incluyendo RAB8A y RAB10, que se unen preferentemente a RILPL1 y RILPL2 cuando están fosforiladas. Se ha descrito que LRRK2 patogénico causa un déficit de cohesión centrosomal en células en división, incluyendo células periféricas de pacientes, en una manera dependiente de su actividad kinasa mediante la fosforilación de RAB8A, que causa su acumulación en un área pericentrosomal. Además, la fosforilación de RAB10 por LRRK2 causa su reclutamiento hacia el centrosoma donde se une a RILPL1, y esta unión se ha demostrado que interfiere con la biogénesis del cilio primario. En la presente tesis doctoral, demostramos que el déficit de cohesión centrosomal mediado por LRRK2 no es sólo causado por la acumulación de RAB8A fosforilado, sino que también interviene RAB10 fosforilado. Utilizando la técnica de CRISPR Cas9, hemos identificado que el déficit de cohesión centrosomal mediado por LRRK2 depende principal y únicamente de la presencia de las proteínas RAB8A, RAB10 y RILPL1. Estudios anteriores han indicado que RILPL1 estaría localizado en el centrosoma. Aquí, hemos identificado por primera vez que RILPL1 está localizado en los apéndices subdistales del centriolo madre, que reclutaría las proteínas RAB fosforiladas por LRRK2 para causar alteraciones centrosomales. Los defectos en ciliogenesis causados por LRRK2 patogénico se correlacionan con la acumulación de fosfo RAB8A y fosfo RAB10. Además, mostramos que los diferentes variantes de LRRK2 que modifican el riesgo de padecer la enfermedad de Parkinson, así como los diferentes reguladores de las rutas de señalización de LRRK2 (vps35 y PPM1H) tienen un efecto en el déficit de cohesión centrosomal. Conjuntamente, nuestros datos sugieren que las alteraciones mediadas por LRRK2 en ciliogénesis y cohesión centrosomal son dos efectos celulares diferentes de un mismo nexo subyacente (fosfo RAB8A/RAB10/RILPL1) y destacan la posibilidad de que las alteraciones de cohesión centrosomal y/o las alteraciones en ciliogénesis puedan servir como biomarcadores para la enfermedad de Parkinson relacionada con LRRK2. De hecho, demostramos que los defectos de cohesión centrosomal y ciliogénesis se pueden observar en condiciones endógenas en astrocitos primarios de ratones portadores de mutaciones en LRRK2 en comparación con ratones control, y son revertidos mediante inhibición de la actividad kinasa de LRRK2. Además, describimos la presencia de déficits de cohesión centrosomal en líneas celulares linfoblastoides derivadas de células mononucleares de sangre periférica en una muestra mayor de pacientes de Parkinson que portan la mutación G2019S de LRRK2 en comparación con individuos sanos, que son observables también en algunos pacientes de Parkinson esporádico, y son revertidos mediante inhibición de la actividad kinasa de LRRK2 en todos los casos. En conjunto, describimos un ensayo biológico celular robusto basado en defectos de cohesión centrosomal que puede permitir la estratificación de pacientes de Parkinson que pueden beneficiarse de terapias relacionadas con LRRK2 en entornos clínicos.