Desarrollo de un protocolo de análisis de la expresión génica mediante «differential display» que reduce el número de falsos positivos

  1. Sánchez Pozo, Antonio
  2. Vieites, J.M.
  3. Suárez, A.
  4. Gil Hernández, Ángel
Revista:
Ars pharmaceutica

ISSN: 2340-9894 0004-2927

Ano de publicación: 2005

Volume: 46

Número: 2

Páxinas: 193-204

Tipo: Artigo

Outras publicacións en: Ars pharmaceutica

Resumo

Entre los métodos empleados para los análisis de la expresión de genes, el método de "differential display" ha sido ampliamente utilizado y, a pesar del uso extendido de los "microarrays", es aún un método válido para el análisis con muestras cuyo transcriptoma es desconocido. Con el objeto de reducir el elevado número de falsos positivos que genera esta técnica, hemos optimizado el protocolo para reducir la posibilidad de generar falsos positivos. En primer lugar, hemos marcado radiactivamente el cebador oligo-dT con lo que los fragmentos de DNA identificados son extremos 3'-UTR de RNAm. Por muestra hemos realizado dos transcripciones inversas y dos reacciones de PCR en cada una de ellas. Para seleccionar un fragmento de DNA, debía estar diferencialmente expresado en las 4 reacciones de PCR. Por último, todos los fragmentos fueron clonados y secuenciados por triplicado. Estas modificaciones al protocolo nos ha permitido identificar 5 genes expresados diferencialmente entre células epiteliales de intestino en estado proliferativo y diferenciado.

Referencias bibliográficas

  • H. Varmus. In oncogenes and the molecular origins of cancer. R.A. Weimberg, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989;pp: 3-44
  • S.W.Lee, C.Tomasseto, R. Sager. Positive selection of candidate tumor-suppressor genes by subtractive hybridization. Proc.
  • Natl. Acad. Sci. U.S.A.1991;88(7):2825-9
  • Kavathas P, Sukhatme VP, Herzenberg LA, Parnes JR. Isolation of the gene encoding the human T-lymphocyte differentiation antigen Leu-2 (T8) by gene transfer and cDNA subtraction. Proc Natl Acad Sci USA. 1984;81(24):7688-92
  • Hubank M, Schatz DG. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res. 1994; 22(25):5640-8
  • Lian P, Pardee A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 1992, 257: 967-971
  • Bauer D. et al. Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR) Nucleic Acids Res. 1993; 21: 4272-4280
  • Lian P, Pardee A.B. Differential display methods and protocols. Methods in molecular biology. 1997 Humana Press, Totowa, New Jersey.
  • Lambrechts AC, Van't Veer LJ, Rodenhuis S. the detection of minimal numbers of contaminating epithelial tumor cells in blood or bone marrow: use, limitations and future of RNA-based methods. Ann Oncol. 1998; 9(12): 1269-76.
  • Carulli JP et al. High throughput analysis of differential gene expression. J. Cell Biochem Suppl. 1998; 30-31:286-96.
  • Hibi K et al. Serial analysis of gene expression in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 1998; 58(24):5690-4
  • McBurney MW, Yang X, Jardine K, Cormier M. A role of RNA processing in regulating expression from transfected genes. Somat Cell Mol Genet. 1998; 24(4):203-15
  • Linskens M.H.K. et al. Cataloging altered gene expression in young and senescent cells using enhanced differential dispaly. Nucleic Acids Res. 1995; 23: 3244-3251.
  • Keshav S, McKnight AJ, Arora R, Gordon S. Cloning of intestinal phospholipase A2 from intestinal ephitelial RNA by diferential display PCR. Cell Prolif. 1997; 30(10-12):369-83
  • Gaede KI et al. Analysis of differential regulated mRNAs in monocytes cells induced by in vitro stimulation. J.Mol.Med 1999; 12: 847-852
  • Ledakis P, Tanimura H, Fojo T. limitations of diferencial display. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 251(2):653-6
  • Mou L et al. Improvements to the differential display method for gene analysis. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994; 199: 564-569.
  • Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ana Biochem. 1987; 162(1):156-9
  • Liang P, Averboukh L, Pardee AB. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acids Res. 1993; 21(14):3269-75
  • Li F, Barnathan ES, Kariko K. Rapid method for screening and cloning cDNAs generated in differential mRNA display: application of northern blot for aaffinity capturing of cDNAs. Nucleic Acids Res. 1994; 22(9):1764-5
  • Rosok O et al. Solid phase method for differential display of genes expressed in hematopoietic stem cells. Biotchniques. 1996 221(1):114-21
  • Zhao S, Ooi SL, and Pardee A.B. New primer strategy improves precisison of differential display. Biotechniques 1995; 18:842-850
  • Chen Z et al. A cautionary note on the reaction tubes for differential display and cDNA amplification in thermal cycling.
  • Biotechniques 1994; 16:1003-1006