Catabolismo del aminoácido aromático fenilalanina por pseudomonas putida kt2440

Resum

Pseudomonas putida KT2440 es una bacteria que se caracteriza por presentar una gran versatilidad de rutas metabólicas en las que participan muchos compuestos de gran interés industrial (Ramos et al. 1995 and Rojas et al. 2004), como son los aminoácidos aromáticos. Los estudios propuestos en esta solicitud tienen por objeto establecer con detalle los mecanismos por los que esta bacteria cataliza aminoácidos aromáticos tales como la fenilalanina y tirosina. Para profundizar en los mecanismos moleculares se proponen una serie de experimentos multidisciplinares basado en estudios de microcalorimetría, microarrays, y genética molecular. Objetivos 1. Estudiar el papel del regulador PhhR en el catabolismo de aminoácidos aromáticos tales como fenilalanina y tirosina en P. putida KT2440. 2. Caracterización de una segunda ruta catabólica de fenilalanina y tirosina. 3. Caracterización del regulón PhhR: activador y represor. 4. Estudio del mecanismo de regulación transcripcional de PhhR. 5. Cristalización de PhhR para obtener la estructura tridimensional. Metodología y plan de trabajo Se va a estudiar el papel de PhhR como regulador en la hidroxilación de la fenilalanina que da lugar a la tirosina, cuyos genes implicados forman el operón phh (Herrera and Ramos, 2007). Se realizarán mutantes tanto en el gen phhR como en los genes phh para estudiar sus fenotipos. Para comprobar la implicación de PhhR sobre la regulación transcripcional del operón phh y sobre su propio promotor, se construirán fusiones del promotor phh a ¿lacZ. Se medirá la actividad ß-galactosidasa tanto en el silvestre como en el mutante phhR. La proteína PhhR con una cola de hexahistidina se sobreexpresará en E. coli y se purificará por medio de cromatografía de afinidad. Esto nos va a permitir realizar ensayos de EMSA y footprint para establecer la unión del regulador al promotor. De esta forma se podrá identificar exactamente la secuencia reconocida por PhhR (caja PhhR). Además se determinarán las constantes de unión y la estequimetría de PhhR al promotor utilizando ITC. De igual forma y utilizando las mismas técnicas se va a estudiar el papel de la proteína IHF en la regulación trascripcional del operón phh. Se van a llevar a cabo ensayos de microarrays a partir de cultivos con medio mínimo y en presencia de fenilalanina en las cepas silvestre y mutante phhR, tanto por separado como enfrentados. A partir de estos resultados se van a estudiar otras posibles rutas catabólicas de la fenilalanina. Se estudiarán aquellos genes que se expresen o se repriman en presencia de este aminoácido aromático. Se construirán mutantes en dichos genes con el fin de caracterizarlos posteriormente. De igual forma se estudiará in vivo la expresión de dichos genes midiendo actividad ß-galactosidasa en fusiones con el gen ¿lacZ de aquellos promotores cuyos genes se hayan visto modificados en los microarrays. Posteriormente a partir de los resultados de los microarrays se van a seleccionar aquellos genes que se expresan o se reprimen como consecuencia de la presencia o ausencia de PhhR. Estos serán genes que de forma directa o indirecta están regulados por el regulador. Con objeto de definir el regulón PhhR, vamos a centrarnos en aquellos genes u operones que presenten una regulación directa con PhhR. Para esto se van a realizar ensayos de calorimetría en los que se tratará de comprobar reconocimiento de PhhR por las cajas encontradas en los promotores de dichos genes (resultados previos de un screening en el genoma). Con objeto de entender el mecanismo de regulación de PhhR en el regulón, se van a definir los puntos de inicio de la trascripción de los genes que componen el regulón y se realizarán ensayos de trascripción in vitro. Se realizarán ensayos de cristalización. Se identificarán las condiciones iniciales a partir de las cuales se obtendrán cristales adecuados para ser difractados. En general, los ensayos de cristalización de reguladores tienen más éxito en presencia de los efectores de la proteína. Por lo tanto, se intentará cristalizar PhhR en presencia de fenilalanina y/o tirosina. Los estudios de difracción, creación de modelos y su refinado se llevarán a cabo posteriormente. La aportación principal de este trabajo será avanzar en el campo de la regulación de rutas catabólicas, caracterizando un nuevo regulón y caracterizando una nueva ruta catabólica de fenilalanina y tirosina. Bibliografía 1. Ramos et al., J. Bacteriol. 1995, 177: 3911-3916. 2. Rojas et al., Appl. Envirom. Microbiol. 2004, 70: 3637-3643. 3. Herrera et al., J.Mol.Biol. 2007, 366(5): 1374-86.