Bionanotecnología aplicada a la regeneración ósea mediante el transporte de biomoléculas usando nanopartículas poliméricasestudio in vitro

Resumen

REGENERACIÓN ÓSEA A PARTIR DE NANO/MICROPARTICULAS DE PLGA CARGADAS DE BMP-2. El ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) es uno de los polímeros sintéticos más ampliamente utilizados para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos y biomoléculas terapéuticas asi como componente principal en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sus propiedades y versatilidad le permiten ser un polímero de referencia en la fabricación de nanopartículas y micropartículas para encapsular y liberar una amplia variedad de moléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Además, sus propiedades de biodegradabilidad y biocompatibilidad hacen del mismo un candidato idóneo para encapsular biomoléculas como proteínas o ácidos nucleicos permitiendo su liberación de forma controlada. Este trabajo se centra en el uso de nanopartículas (NP) de PLGA como un sistema de entrega de uno de los factores de crecimiento más comúnmente utilizados en la ingeniería del tejido óseo, la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2). Por lo tanto, examinamos todos los requisitos necesarios para alcanzar una correcta encapsulación y una liberación controlada y sostenida de BMP2 utilizando partículas de PLGA como componente principal, discutiendo todos los problemas y soluciones que hemos encontrado para el desarrollo adecuado de este sistema con un gran potencial en el proceso de diferenciación celular y proliferación bajo el punto de vista de la regeneración ósea. Hemos desarrollado y optimizando dos métodos de formulación diferentes para obtener NP de PLGA cargadas con una proteína modelo con actividad enzimática como la lisozima que posee características similares a la BMP2. Estas formulaciones se basan en una técnica de doble emulsión con evaporación de solvente (agua / aceite / agua, W/O/W). Se diferencian principalmente en la fase en la que se agrega el surfactante (Pluronic® F68): agua (W-F68) o aceite (O-F68). Este surfactante polimérico no iónico puede modular una serie de propiedades del nanosistema transportador en el que se integra, reduciendo el tamaño de las NPs, incrementando su estabilidad coloidal y facilitando la protección de la biomolécula encapsulada. Además, gracias a su disposición superficial y la hidrofilidad de sus colas polares se reduce la interacción con el sistema fagocítico mononuclear con una mejora de la biodistribución al aumentar su tiempo de circulación después de una administración intravenosa en un organismo vivo. Analizamos las propiedades coloidales de estos sistemas usando diferentes técnicas experimentales: (morfología por SEM y STEM, tamaño hidrodinámico por DLS y NTA, movilidad electroforética, estabilidad temporal en diferentes medios); así como la encapsulación, patrón de liberación y bioactividad de la lisozima. Asimismo, realizamos una caracterización interfacial de la interacción surfactante-proteína en la primera emulsión agua-aceite para cada procedimiento de formulación mediante el análisis de la tensión superficial y la elasticidad. Finalmente, examinamos la captación celular por células estromales mesenquimáticas humanas y la citotoxicidad para ambos nanosistemas. Mediante las dos formulaciones, O-F68 y W-F68, se obtienen NPs sólidas de morfología esférica si bien en un caso, el sistema presenta monodispersidad con diámetros alrededor de 120 nm (O-F68), en el otro se obtiene un nanosistema polidisperso con diámetros de partícula comprendidos entre 100 y 500 nm. (W-F68). Como resultado más relevante observamos que la eficacia de encapsulación, la liberación y la bioactividad de la lisozima se han mantenido mejor con el método de formulación W-F68. En este caso, dada la heterogeneidad de tamaños, se podría hablar de un prometedor sistema multimodal para encapsular proteínas con una fuerte actividad biológica que permita una “entrega dual” a nivel extra- e intracelular facilitando la actividad proteica en la superficie celular y en el citoplasma. Tras desarrollar y optimizar el método de síntesis para las NPs de PLGA cargadas de lisozima, tratamos de adaptar la formulación para conseguir la encapsulación de la proteína terapéutica BMP-2. Así, basándonos en los resultados obtenidos con la lisozima, se ha optado por usar el procedimento de síntesis W-F68 para favorecer la protección de las moléculas proteicas y su actividad biológica. Con esta formulación se han obtenido, con buena reproducibilidad, NPs esféricas con el tamaño multimodal referido anteriormente, entre 100 y 500 nm, que posibilitarán el suministro extra- e intracelular. Además de NPs con BMP2 encapsulada obtenemos un nanosistema en el que la BMP2 no está encapsulada sino co-adsorbida superficialmente junto a una proteína estabilizadora como la albúmina de suero bovino. De nuevo, se lleva a cabo una completa caracterización fisico-química y biológica de ambos sistemas de NPs analizando las propiedades indicadas previamente, esto es: morfología y tamaño, carga superficial, estabilidad coloidal y temporal, encapsulación y patrón de liberación. Es conocido que la cinética de liberación en los sistemas poliméricos basados en PLGA dependen en gran medida de la degradación hidrolítica del polímero. Sin embargo, la liberación a tiempos cortos está influenciada por otros procesos físicos y es crucial evitar una descarga inicial excesiva sobre todo si se quiere optimizar la aplicación de esta nanotecnología en procesos de regeneración ósea muy importantes en odontología. En consecuencia hemos incidido en el análisis del patrón de liberación de la BMP2 a tiempos cortos utilizando diferentes técnicas y comparando el comportamiento de los dos sistemas de NPs con la proteína encapsulada o adsorbida superficialmente. Finalmente, se ha analizado la actividad biológica de las NPs cargadas con BMP2 mediante estudios in vitro de proliferación celular, migración y diferenciación osteogénica usando para ello células estromales mesenquimales obtenidas a partir de hueso alveolar humano (ABSC). En base a todo esto, se puede confirmar que las NPs con BMP2 encapsuladas presentan un patrón de liberación adecuado a corto plazo, manteniendo un suministro proteico sostenido y una actividad biológica adecuada para dosis iniciales de BMP2 muy reducidas.