Diseño, caracterización y evaluación de la seguridad de envases activos desarrollados con aceites esenciales

Resumen

RESUMEN Las nuevas tendencias alimentarias constituyen un reto para la industria alimentaria que debe lanzar al mercado productos atractivos para los consumidores, cada vez más informados y preocupados por el binomio calidad-seguridad. Por otro lado, la globalización alimentaria hace necesario desarrollar nuevos materiales de envasado que permitan a las mercancías recorrer largas distancias y permanecer más tiempo en condiciones óptimas en los canales de distribución. Una de las estrategias que la industria ha encontrado para cubrir esta necesidad ha sido el diseño de envases activos. Estos materiales que incorporan sustancias con propiedades biológicas, permiten aumentar la vida útil de los alimentos manteniendo sus cualidades nutricionales y su seguridad al crear, en el caso que nos ocupa, una atmósfera protectora en contacto con el alimento. Los aceites esenciales (AEs), productos aromáticos sintetizados en distintas partes de las plantas, han mostrado a lo largo de los siglos un gran atractivo tanto por su agradable aroma, como por las propiedades biológicas (antioxidantes, antimicrobianas, antiparasitarias, etc.) con las que se han relacionado. En este sentido, y teniendo en cuenta que los consumidores responden de manera positiva a la sustitución de aditivos sintéticos por nuevos aditivos naturales con mejor percepción de seguridad, la industria alimentaria se hace eco y pone el foco en este tipo de sustancias. Para que un AE sea aprobado como aditivo alimentario o como sustancia activa y pueda ser incorporada legalmente al envasado activo, la Unión Europea (UE), a través de Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), exige una exhaustiva evaluación de la toxicidad de estas sustancias para confirmar la seguridad asociada a su uso. Uno de los aspectos fundamentales que se exigen para esta evaluación es el estudio del daño al material genético que las sustancias pueden producir. Por ello, nos pareció fundamental revisar la bibliografía existente relacionada con la genotoxicidad de los AEs utilizados habitualmente en alimentación y de manera más concreta de aquellos aceites seleccionados para desarrollar envases activos. El estudio de la bibliografía publicada mostró ausencia de potencial mutagénico y genotóxico para una amplia variedad de los AEs evaluados, así como para sus componentes mayoritarios. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han llevado a cabo respetando solo en parte las recomendaciones de la EFSA o las guías propuestas por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE). Por este motivo, se hace necesario reevaluar estas sustancias siguiendo las directrices propuestas por las autoridades europeas. La revisión bibliográfica citada ha dado lugar a la siguiente publicación: • IN VITRO TOXICOLOGICAL EVALUATION OF ESSENTIAL OILS AND THEIR MAIN COMPOUNDS USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING: A REVIEW. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015; Food and Chemical Toxicology 81, 9-27) Con objeto de reevaluar en profundidad, y de acuerdo a la nueva legislación europea, las posibles sustancias utilizadas para el desarrollo de envase activos, se seleccionaron para la presente tesis doctoral los extractos de aliáceas y el aceite esencial de orégano (AEO), tanto por sus propiedades activas como por la ausencia o contradicción de los resultados toxicológicos existentes. Para diseñar la evaluación de la toxicidad, se tuvo en cuenta que la vía oral va a ser la de exposición preferente para estos AEs puesto que los consumidores estarán expuestos a ellas a través del alimento. Así, para la evaluación in vitro se seleccionaron modelos celulares del aparato digestivo. En primer lugar, las células de hepatocarcinoma humano (HepG2) como modelo hepático por ser el hígado el órgano principal involucrado en la biotransformación de xenobióticos. Por otro lado, las células de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2) por ser el intestino el órgano encargado de la absorción y donde existe un mayor tiempo de contacto con las sustancias estudiadas. Para evaluar la toxicidad in vitro de los componentes mayoritarios de los AEs, las líneas celulares fueron expuestas a compuestos sulfurados presentes en los extractos de aliáceas (dipropil sulfuro (DPS), dipropil disulfuro (DPDS) y propil propano tiosulfonato (PTSO)) y a compuestos fenólicos mayoritarios del AEO (carvacrol y timol). Dentro de la batería de ensayos llevados a cabo se incluyeron estudios de citotoxicidad basal, análisis de la morfología celular, estrés oxidativo (producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y contenido en glutatión reducido (GSH)), muerte celular por citometría de flujo y actividad antioxidante (incluyendo protección y reversión del daño inducido por oxidantes, como peróxido de hidrógeno). Además, se evaluó el potencial mutagénico de estas sustancias mediante el test de Ames, utilizando 5 cepas de Salmonella thyphimurium auxotrófas para histidina y se incluyó el ensayo cometa estándar y modificado con enzimas de restricción endonucleasa III (Endo-III) y formamidopirimidina glicosila (FPG), para evaluar el potencial genotóxico. Por último, para completar la evaluación del PTSO, se realizó un ensayo de toxicidad oral aguda para determinar la dosis máxima tolerable (DMT) en roedores. De manera general, tanto los compuestos sulfurados DPS y DPDS como el timol, mostraron ausencia de toxicidad a las concentraciones ensayadas. En los casos de PTSO y carvacrol se observaron daños, a concentraciones superiores a las que se utilizarían en envasado activo, estableciéndose una DMT en roedores de 55 mg/Kg peso corporal (pc) para PTSO. Además, los resultados han revelado que el carvacrol induce actividad mutagénica y presenta capacidad para oxidar las bases púricas del ADN. Los resultados obtenidos de estos ensayos han dado lugar a las siguientes publicaciones: • ESTUDIO IN VITRO DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS CACO-2 EN PRESENCIA DE COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE ALLIUM SPP. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2013, Revista Española de Toxicología 30, 144-148). • CYTOTOXIC AND MUTAGENIC IN VITRO ASSESSMENT OF TWO ORGANOSULFUR COMPOUNDS DERIVED FROM ONION TO BE USED IN THE FOOD INDUSTRY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Food Chemistry 166, 423-431). • ACUTE TOXICOLOGICAL STUDIES OF THE MAIN ORGANOSULFUR COMPOUND DERIVED FROM ALLIUM SP. INTENDED TO BE USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Food and Chemical Toxicology 82, 1-11). • CYTOTOXICITY AND MORPHOLOGICAL EFFECTS INDUCED BY CARVACROL AND THYMOL ON THE HUMAN CELL LINE CACO-2. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2014. Food and Chemical Toxicology 64, 281-290). • EVALUATION OF THE MUTAGENICITY AND GENOTOXIC POTENTIAL OF CARVACROL AND THYMOL USING THE AMES SALMONELLA TEST AND ALKALINE, ENDO-III AND FPG-MODIFIED COMET ASSAYS WITH THE HUMAN CELL LINE CACO-2.(Llana-Ruiz-Cabello et al., 2014. Food and Chemical Toxicology 72, 122-128). • IN VITRO PRO-OXIDANT/ANTIOXIDANT ROLE OF CARVACROL, THYMOL AND THEIR MIXTURE IN THE INTESTINAL CACO-2 CELL LINE. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Toxicology in Vitro 29, 647-656). Tras valorar todos los resultados obtenidos in vitro, se impuso la necesidad de evaluar in vivo la toxicidad de las sustancias. En primer lugar, porque la legislación europea (EFSA 2016) exige llevar a cabo un estudio de toxicidad oral subcrónica a 90 días para todas aquellas sustancias que vayan a ser incluidas en materiales de envasado alimentario y cuya exposición se prevea superior a 1,5 μg/kg pc al día. Se seleccionaron ratas Wistar a las que se administró AEO durante 90 días. Transcurrido el período de exposición, los animales fueron sacrificados, y se extrajeron los órganos y la sangre, para llevar a cabo una evaluación histopatológica, bioquímica y hematológica. Los resultados obtenidos en este estudio no mostraron efectos adversos para ninguna de las dosis administradas, y de ellos se dedujo un NOAEL de 200 mg/kg pc para AEO (Origanum vulgare L. virens) para el citado modelo experimental. Estos resultados dieron lugar a la siguiente publicación: • A SUBCHRONIC 90-DAY ORAL TOXICITY STUDY OF ORIGANUM VULGARE ESSENTIAL OIL IN RATS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Food and Chemical Toxicology 101, 36-47). La segunda razón que nos llevó a estudiar la toxicidad in vivo fue que la guía para evaluar la genotoxicidad de las sustancias (EFSA, 2011) insta a confirmar in vivo la genotoxicidad contradictoria o no concluyente obtenida in vitro. Teniendo en cuenta las recomendaciones del citado documento, se seleccionaron el ensayo de micronúcleos (MN) en médula ósea; y el ensayo cometa, en estómago, hígado y sangre periférica, para evaluar el potencial genotóxico de carvacrol y AEO in vivo. Ambas sustancias mostraron resultados negativos para los dos ensayos, y también ausencia de alteraciones histopatológicas, en todos los tejidos evaluados. Según las propuestas por la OCDE para llevar a cabo estos ensayos, la ausencia de toxicidad debe ser corroborada con algún método que confirme que los tejidos diana has estado expuestos a las sustancias objeto de estudio (OCDE 474 y OCDE 489). En este sentido, y por primera vez según nuestro conocimiento, se ha llevado a cabo pirolisis analítica como técnica para demostrar presencia de compuestos naturales en muestras biológicas. Los resultados obtenidos de estos trabajos se recogen en las siguientes publicaciones: • GENOTOXICITY EVALUATION OF CARVACROL IN RATS USING A COMBINED MICRONUCLEUS AND COMET ASSAY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Food and Chemical Toxicology 98, 240-250). • COMBINED MICRONUCLEUS AND COMET ASSAY TO EVALUATE THE GENOTOXICITY OF OREGANO ESSENTIAL OIL (ORIGANUM VULGARE L. VIRENS) IN RATS ORALLY EXPOSED FOR 90 DAYS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Food Research International (en revisión/under revision)) Durante la realización de esta tesis, la doctoranda llevó a cabo varias estancias nacionales (ITENE (Valencia), y DOMCA S.A.U. (Granada)) para desarrollar y caracterizar materiales activos diseñados con las sustancias objeto de estudio. Se desarrollaron envases a base de matrices plásticas tradicionales como el polipropileno (PP), y otros utilizando nuevos polímeros biodegradables como el ácido poliláctico (PLA). En estas matrices se incorporaron mediante extrusión un extracto de aliáceas (Proallium®) y AEO a diferentes concentraciones y se procedió a la caracterización físico-mecánica de los nuevos materiales, evaluando además las propiedades ópticas y térmicas. Por otro lado, se llevó a cabo la evaluación de la funcionalidad de estos nuevos envases como materiales antioxidantes y antimicrobianos y su capacidad para intervenir en la vida útil de lechugas de cuarta gama y jamón cocido. De manera general, todos los materiales diseñados mostraron propiedades físico-mecánicas, ópticas y térmicas compatibles con el envasado alimentario. Sin embargo, la vida útil de los alimentos envasados en ellos no se ha visto incrementada en ninguno de los casos, incluso cuando los materiales han mostrado actividad antioxidante y/o antimicrobiana. Los resultados obtenidos de estos ensayos se incluyen en las siguientes publicaciones: • CHARACTERISATION AND EVALUATION OF PLA FILMS CONTAINING AN EXTRACT OF ALLIUM SPP. TO BE USED IN THE PACKAGING OF READY-TO-EAT SALAD UNDER CONTROLLED ATMOSPHERES. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. LWT-Food Science and Technology 64, 1354-1361). • DEVELOPMENT OF PLA FILMS CONTAINING OREGANO ESSENTIAL OIL (ORIGANUM VULGARE L. VIRENS) INTENDED FOR USE IN FOOD PACKAGING. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Food Additives and Contaminants: Part A 33, 1374-1386). • CHARACTERIZATION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ACTIVE POLYPROPYLENE FILMS CONTAINING ORIGANUM AND ALLIUM EXTRACTS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. LWT-Food Science and Technology (en revisión/under revision)) Teniendo en cuenta la alta volatilidad de los extractos naturales y las altas temperaturas que se alcanzan en los procesos de extrusión de plásticos, es importante determinar que las concentraciones de activo en el material final siguen siendo funcionales. Habitualmente, la termogravimetría (TGA) o la calorimetría diferencial de barrido (DSC) han sido utilizadas con este fin y por ello han sido incluidas en la caracterización de los materiales de la presente tesis. Sin embargo, y tras valorar el potencial de la pirolisis analítica (Py-GC/MS) como técnica para determinar compuestos naturales en matrices bio, se han llevado a cabo diferentes estudios para confirmar el contenido de sustancias activas en las matrices poliméricas utilizando esta técnica. Los resultados obtenidos mediante pirolisis analítica reflejados en las siguientes publicaciones, son muy similares a los proporcionados por las técnicas tradicionales (TGA y DSC), demostrando que la pirólisis es una técnica rápida y útil para identificar y cuantificar aditivos naturales en matrices poliméricas biodegradables. • CHARACTERISATION OF A BIO-BASE PACKAGING CONTAINING A NATURAL ADDITIVE FROM ALLIUM SPP. USING ANALYTICAL PYROLYSIS AND CARBON STABLE ISOTOPES. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 120, 334-340). • MOLECULAR CHARACTERISATION OF A BIO-BASED ACTIVE PACKAGING CONTAINING ORIGANUM VULGARE L. ESSENTIAL OIL USING PYROLYSIS GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Journal of the Science of Food and Agriculture 96, 3207-3212). • MONITORING NATURAL ADDITIVES IN POLYLACTIC ACID ACTIVE FOOD PACKAGES. PYROLYSIS-GAS CHROMATOGRAPHY-ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY ANALYSIS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Journal of Chromatography A. (en revisión/under revision)) Tras observar que la vida útil no había aumentado en ninguno de los modelos experimentales, decidimos valorar si el perfil nutricional del alimento sufría cambios durante la etapa de almacenamiento en los envases activos en relación a los cambios que se producen en envasado tradicional. Para ello seleccionamos los films diseñados a partir de PLA con AEO y estudiamos, mediante Py-GC/MS, el perfil nutricional de la lechuga envasada en estos materiales. Los resultados han mostrado que los films de PLA con AEO consiguen mantener los niveles de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y de fitosteroles durante el tiempo de vida útil de la lechuga. Estos resultados darán lugar a la siguiente publicación: • EFFECT OF AN ACTIVE BIO-PACKAGE IN THE PRESERVATION OF NUTRITIONALLY IMPORTANT PHYTOCONSTITUENTS IN READY-TO-EAT LETTUCE. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Journal of Food Composition and Analysis (en revision/under revision)) Además, y teniendo en cuenta que ambos activos (Proallium® y AEO) tienen actividades complementarias, habiendo mostrado el Proallium® mayor efecto antimicrobiano y el AEO mayor efecto antioxidante, consideramos interesante diseñar un material de envasado que incorporase ambos. Se ha utilizado una matriz de PLA y se han incorporado los activos mediante extrusión, procediéndose a desarrollar la caracterización físico-mecánica llevada a cabo para el resto de materiales y la evaluación de la funcionalidad en lechugas de cuarta gama para poder comparar los resultados con los obtenidos para los materiales que solo incorporan un activo. Los resultados de estos estudios darán lugar a la siguiente publicación: • CHARACTERISATION OF A BIO-BASED POLYLACTIC ACID PACKAGING CONTAINING PROALLIUM AND OEO (Título provisional) Por último, para confirmar la seguridad derivada del uso de esta combinación, decidimos evaluar la toxicidad de la mezcla de los componentes mayoritarios de ambos activos (PTSO y carvacrol) en las líneas celulares HepG2 y Caco-2 mediante ensayos de citotoxicidad y alteraciones morfológicas ultraestructurales. Los resultados de estos estudios darán lugar a la siguiente publicación: • CITOTOXICITY, MORPHOLOGICAL EFFECTS AND SINERGIES OBSERVED IN MIXTURES CONTAINING PTSO AND CARVACROL (Título provisional) SUMMARY New trends in consumer demand, increasingly informed and concerned about the quality and safety of food, are affecting the food industry, which need to launch to the market attractive products to consumers. Moreover, changes in retailing practices due to globalization force the industry to develop new packaging materials that allow food to travel long distances and to maintain its properties in perfect conditions through the distribution channels. One of the strategies that the industry has found to fulfill this need has been the design of active packaging. Active food contact materials can incorporate substances with biological properties, which are intended to be released into the headspace of packages with the aim of increasing the shelf-life of food maintaining its nutritional profiles and safety. Essential oils (EOs), secondary metabolites which are produced in different parts of the plants, have been traditionally proved to have many applications due to their flavor and fragrance for flavoring foods, as well as due to their bioactive properties such as antioxidant or antimicrobial characteristics. In this sense, considering that consumers are willing the substitution of synthetic additives for natural ones with a relative safe status, food industry has focused on using such substances. In Europe, the EOs allowed to be used as additive or as active substance in food packaging should be approved by the European Commission after the safety assessment developed by the European Food Safety Authority (EFSA), because the safety of these substances should be guaranteed before being commercialized. One of the main aspects required in the safety assessment is to evaluate the mutagenic and genotoxic potential of these substances. Therefore, it is important to carry out a comprehensive review of the genotoxicity data published in the scientific literature up to now regarding EOs intended to be used in food, and more specifically, regarding those oils selected to develop active packaging. The study of the published literature showed absence of mutagenic and genotoxic potential for a wide variety of EOs evaluated, as well as for their main compounds. However, most of these studies has only partially followed the recommendations by EFSA and the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) protocols. Consequently, it is necessary to perform complete studies following the guidelines proposed by the European Authorities. This review has led to the following publication: • IN VITRO TOXICOLOGICAL EVALUATION OF ESSENTIAL OILS AND THEIR MAIN COMPOUNDS USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING: A REVIEW. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015; Food and Chemical Toxicology 81, 9-27) In order to evaluate in depth the safety of EOs according to the European legislation, oregano essential oil (OEO), Allium spp. extracts and their main compounds, were selected as the main topic of study in this Doctoral Thesis due to their active properties and because of the results published are scarce or contradictory. In order to design the toxicological assessment, the experimental models were chosen to represent oral exposure to these substances taking into account that consumers will be exposed to them through the food. Therefore, for the in vitro assessment, human hepatoma cell line (HepG2) was selected because the liver is the most active organ in metabolism of substances and colon adenocarcinoma cell line (Caco-2) was chosen because the intestine is considered as site-of-contact tissue and main absorption site. For the in vitro evaluation of the major components of EOs cell lines were exposed to the main organosulfur compounds in Allium spp. extracts (dipropyl sulphide (DPS), dipropyl disulphide (DPDS) and propyl propane thiosulfonate (PTSO)), and were also exposed to phenolic compounds observed in OEO (carvacrol and thymol). The experiments performed were: basal cytotoxicity, cell morphology, oxidative stress (production of reactive oxygen species (ROS) and glutathione content (GSH)), mechanisms of death with flow cytometry and antioxidant activity (including protection and reversion effects against hydrogen peroxide). Moreover, the mutagenic effects of these substances were developed by the Ames test using five different strains of Salmonella thyphimurium that carry mutations in genes involved in histidine synthesis. Furthermore, the genotoxicity of these compounds were evaluated through the standard and modified-comet assays using endonuclease III (ENDO-III) and formamidopyrimidine DNA glicosilase (FPG) to measure oxidized pyrimidines and purines, respectively. Finally, in order to complete the PTSO evaluation, an in vivo study was conducted in rats orally expose to this substance to establish it maximum tolerated dose (MTD). In general, no toxicity was observed for DPS, DPDS and thymol at the concentrations assayed. However, toxic effects were observed in both cell lines after exposure to PTSO and carvacrol at concentrations higher than those which are expected to be used in active packaging. Moreover, the MTD of PTSO was set at 55 mg/kg body weight (bw). In addition, results showed that carvacrol were able to produce mutagenic activity and ability to oxidize purine bases. The results of these experiments have led to the following publications: • ESTUDIO IN VITRO DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS CACO-2 EN PRESENCIA DE COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE ALLIUM SPP. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2013, Revista Española de Toxicología 30, 144-148). • CYTOTOXIC AND MUTAGENIC IN VITRO ASSESSMENT OF TWO ORGANOSULFUR COMPOUNDS DERIVED FROM ONION TO BE USED IN THE FOOD INDUSTRY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Food Chemistry 166, 423-431). • ACUTE TOXICOLOGICAL STUDIES OF THE MAIN ORGANOSULFUR COMPOUND DERIVED FROM ALLIUM SP. INTENDED TO BE USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Food and Chemical Toxicology 82, 1-11). • CYTOTOXICITY AND MORPHOLOGICAL EFFECTS INDUCED BY CARVACROL AND THYMOL ON THE HUMAN CELL LINE CACO-2. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2014. Food and Chemical Toxicology 64, 281-290). • EVALUATION OF THE MUTAGENICITY AND GENOTOXIC POTENTIAL OF CARVACROL AND THYMOL USING THE AMES SALMONELLA TEST AND ALKALINE, ENDO-III AND FPG-MODIFIED COMET ASSAYS WITH THE HUMAN CELL LINE CACO-2.(Llana-Ruiz-Cabello et al., 2014. Food and Chemical Toxicology 72, 122-128). • IN VITRO PRO-OXIDANT/ANTIOXIDANT ROLE OF CARVACROL, THYMOL AND THEIR MIXTURE IN THE INTESTINAL CACO-2 CELL LINE. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. Toxicology in Vitro 29, 647-656). After having studied all the results obtained in vitro, the need to evaluate the in vivo toxicity of the substances was evidenced. First of all because the European legislation request in vivo toxicity evaluation of EOs and their main compounds in the tiered approach to toxicity testing, demanding an extended 90-day oral toxicity study in rodents for substances intended to be used in food contact materials and whose estimating exposure level for humans are greater than 1.5 µg/kg bw per day (EFSA, 2016). To develop the repeated-dose oral assay, wistar rats were exposed to OEO during 90 days. At the end of the exposure period, the animals were sacrificed, and organs and blood were removed for histopathological, biochemical and haematological evaluation. The results obtained in this study did not show adverse effects for any dose administered. Therefore, the oral no-observed-adverse-effect level (NOAEL) was set at 200 mg/kg bw of OEO (Origanum vulgare L. virens). The results obtained are compiled in the following publication: • A SUBCHRONIC 90-DAY ORAL TOXICITY STUDY OF ORIGANUM VULGARE ESSENTIAL OIL IN RATS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Food and Chemical Toxicology 101, 36-47). Secondly, in the case of inconclusive or contradictory results, as well as positive results from the in vitro assays, it may be appropriate to conduct further in vivo tests (EFSA, 2011). According to the European recommendations, micronucleus (MN) assay in bone marrow and comet assay in stomach, liver and blood samples were developed to evaluate the in vivo genotoxic potential of OEO and its main compound, carvacrol. Results revealed absence of genotoxicity for OEO and carvacrol in both assays. Moreover, no histopathological changes were observed in any of the tissues evaluated. Finally, according to OECD protocols the negative results must be corroborated by a method that confirms that target tissues have been exposed to the substances under study (OECD 474 and OECD 489). As far as we know, analytical pyrolysis (Py-GC/MS) was developed for the first time to verify that the test chemical reached the target tissue, or general circulation. The results are summarized in the following publications: • GENOTOXICITY EVALUATION OF CARVACROL IN RATS USING A COMBINED MICRONUCLEUS AND COMET ASSAY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Food and Chemical Toxicology 98, 240-250). • COMBINED MICRONUCLEUS AND COMET ASSAY TO EVALUATE THE GENOTOXICITY OF OREGANO ESSENTIAL OIL (ORIGANUM VULGARE L. VIRENS) IN RATS ORALLY EXPOSED FOR 90 DAYS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Food Research International (en revisión/under revision)) For the fulfillment of this thesis, the PhD student performed an internship in ITENE (Valencia, Spain) and DOMCA S.A.U (Granada, Spain) in order to develop and characterize different active materials. New active films based on traditional plastic matrices such as polypropylene (PP), and others using new biodegradable polymers such as polylactic acid (PLA) containing Proallium® and OEO were obtained by melt blending and its evaluation was performed through different assays: physical, mechanical, optical and thermal properties. Moreover, antioxidant and antimicrobial properties of these new films were also evaluated in vitro and in real food models such as lettuce and cooked ham. In general, the new material showed good physical and mechanical properties compatible food packaging. However, the shelf-life of perishable food has not been improved in any case, even when the films exhibited antioxidant and antimicrobial properties. The results obtained in these experiments have led to the following publications: • CHARACTERISATION AND EVALUATION OF PLA FILMS CONTAINING AN EXTRACT OF ALLIUM SPP. TO BE USED IN THE PACKAGING OF READY-TO-EAT SALAD UNDER CONTROLLED ATMOSPHERES. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015. LWT-Food Science and Technology 64, 1354-1361). • DEVELOPMENT OF PLA FILMS CONTAINING OREGANO ESSENTIAL OIL (ORIGANUM VULGARE L. VIRENS) INTENDED FOR USE IN FOOD PACKAGING. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Food Additives and Contaminants: Part A 33, 1374-1386). • CHARACTERIZATION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ACTIVE POLYPROPYLENE FILMS CONTAINING ORIGANUM AND ALLIUM EXTRACTS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. LWT-Food Science and Technology (en revisión/under revision)) Due to the high volatility of EOs and the high temperatures reached in the plastic extrusion processes, it is necessary to ensure that the active substances remain in the desired quantities in the final manufactured polymer. Thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC) are common techniques to evaluate this aspect; and therefore they have been included in the characterization of the materials of the present thesis. However, after assessing the potential of analytical pyrolysis as a technique for determining natural compounds in biomatrices, different studies have been carried out to confirm the content of active substances in the polymer matrices using this technique. Results obtained for Py-GC/MS revealed similar data than obtained by TGA and DSC; hence, the Py-GC/MS seems to be a convenient method for inexpensive and relatively rapid analysis of synthetic or bio-based polymers including EOs. The results obtained in these experiments were summarized in the following publications: • CHARACTERISATION OF A BIO-BASE PACKAGING CONTAINING A NATURAL ADDITIVE FROM ALLIUM SPP. USING ANALYTICAL PYROLYSIS AND CARBON STABLE ISOTOPES. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 120, 334-340). • MOLECULAR CHARACTERISATION OF A BIO-BASED ACTIVE PACKAGING CONTAINING ORIGANUM VULGARE L. ESSENTIAL OIL USING PYROLYSIS GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2016. Journal of the Science of Food and Agriculture 96, 3207-3212). • MONITORING NATURAL ADDITIVES IN POLYLACTIC ACID ACTIVE FOOD PACKAGES. PYROLYSIS-GAS CHROMATOGRAPHY-ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY ANALYSIS. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Journal of Chromatography A. (en revisión/under revision)) Considering that the new materials were not able to improve the shelf-life of food, we decided to assess if the nutritional profile of the food underwent changes during the storage stage in the active materials in relation to the changes that occur in traditional packaging. The evaluation of the nutritional profile of lettuce packaged with PLA films containing OEO has been developed using Py-GC/MS. Results showed that PLA containing OEO allow maintaining the profile of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and phytosterols during the shelf life lettuce. This data are compiled in the following publication: • EFFECT OF AN ACTIVE BIO-PACKAGE IN THE PRESERVATION OF NUTRITIONALLY IMPORTANT PHYTOCONSTITUENTS IN READY-TO-EAT LETTUCE. (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2017. Journal of Food Composition and Analysis (en revision/under revision)) Moreover, taking into account that both active (Proallium® and OEO) have complementary activities, Proallium® have shown greater antimicrobial effect and OEO greater antioxidant effect, films containing Proallium® and OEO were developed. These new films were designed to include both active substances by melt blending into PLA matrices. Physical and mechanical characterization was carried out and the antimicrobial activity of films in ready to eat salad was also assayed. These results will be included in the following publication: • CHARACTERISATION OF A BIO-BASED POLYLACTIC ACID PACKAGING CONTAINING PROALLIUM AND OEO (provisional title) Finally, in order to confirm the safety of the Proallium®-OEO mixture, the in vitro cytotoxicity and morphological effects of the mixture of their main compounds, PTSO and carvacrol, respectively in HepG2 and Caco-2 cells were developed. These results will be included in the following publication: CITOTOXICITY, MORPHOLOGICAL EFFECTS AND SINERGIES OBSERVED IN MIXTURES CONTAINING PTSO AND CARVACROL (provisional title)