Desarrollo de métodos para evaluar el potencial saludable del aceite de oliva virgen y estudiar la asociación entre calidad y compuestos minoritarios

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis El valor saludable del aceite de oliva virgen (AOV) y virgen extra (AOVE) se explica por su perfil de ácidos grasos, con predominio de ácidos grasos monoinsaturados, y por su heterogénea composición en componentes minoritarios, entre los que destaca la presencia de los compuestos fenólicos, cuya bioactividad y capacidad antioxidante han sido ampliamente demostrados [1]. De hecho, los fenoles del AOV constituyen la única familia de componentes que le confieren a este alimento una declaración saludable específica, por encontrarse solo en este producto y, particularmente en las categorías virgen y virgen extra. Además de las propiedades saludables, los compuestos fenólicos contribuyen a las propiedades organolépticas del AOV(E) y, junto al perfil de ácidos grasos, a la estabilidad oxidativa. Debido a sus propiedades saludables, el AOV(E) es un pilar fundamental en la dieta Mediterránea y, en este sentido, un alimento esencial en muchos estudios nutricionales. Por otro lado, el valor saludable de la fracción fenólica del AOV(E) viene avalado por la declaración saludable de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y recogida en el Reglamento Europeo 432/2012, que esencialmente reconoce el efecto beneficioso del consumo diario de AOV(E) con un contenido fenólico (hidroxitirosol, tirosol y derivados) superior a 250 mg/kg [2, 3]. La motivación principal de la Tesis Doctoral fue el desarrollo de nuevos métodos analíticos cualitativos y cuantitativos que permitieran establecer el valor saludable del AOV(E), la influencia de la producción en AOV(E), el nivel de fijación de dietas basadas en AOV(E) como principal fuente de grasa, y estudiar la evolución del aceite tras su almacenamiento y uso culinario. A pesar de que los hitos indicados han sido abordados previamente por numerosos grupos de investigación, las metodologías existentes no son acordes o están relativamente desfasadas. Así, para los estudios de fijación de dieta existen método de determinación del perfil de ácidos grasos en suero/plasma y de compuestos fenólicos en biofluidos [4]. Sin embargo, los primeros no discriminan sobre qué familia de ácidos grasos determinan (enlazados a triglicéridos o a fosfolípidos esencialmente) y los segundos se basan en protocolos de preparación de muestra largos y tediosos. En relación con los métodos de determinación de compuestos fenólicos en AOV(E), los métodos existentes y considerados de referencia no responden a la declaración saludable y, por tanto, no son válidos [5, 6]. En este trabajo se ha utilizado un método que sí responde a la declaración saludable por estar basado en una cuantificación absoluta y que pretende ser adaptado al análisis de rutina en la investigación que se plantea en esta memoria [7, 8]. Puesto que no se han desarrollado estudios durante varias campañas agronómicas sobre la influencia de factores agronómicos, tecnológicos o varietales sobre el perfil fenólico del AOV(E), hay un desconocimiento generalizado en esta parcela, que indudablemente es de gran valor para conseguir AOV(E)s saludables. Finalmente, los métodos de evaluación de la calidad del AOV(E) no consideran el efecto que juegan determinadas familias químicas presentes en este producto [9, 10]. Con vistas a conocerlo mejor, resulta muy importante estudiar qué influencia tienen determinadas familias químicas del AOV(E) sobre parámetros de calidad. 2.Contenido de la investigación El objetivo básico de la investigación recogida en la Memoria de Tesis fue determinar familias minoritarias presentes en aceite de oliva virgen (AOV) y virgen extra (AOVE) y estudiar su variabilidad en función de diferentes factores para reforzar la competitividad de ambos productos a partir de dos pilares fundamentales: la calidad y su valor saludable. Este objetivo se dividió en cuatro objetivos generales de acuerdo con los diferentes temas de esta investigación: (i) Evaluar la influencia de diferentes factores en el contenido fenólico del AOV(E) y, por tanto, sobre su valor saludable atendiendo a la declaración saludable recogida en el Reglamento Europeo 432/2012; (ii) Caracterizar la fracción de glicerofosfolípidos en diferentes categorías de aceite de oliva y en otros aceites vegetales refinados aprovechando la combinación entre sensibilidad y selectividad del analizador de triple cuadrupolo (QqQ); (iii) Estudiar el comportamiento de dos familias de componentes bioactivos del AOV(E) (fenoles y triterpenos) durante el proceso de extracción de este a partir del análisis de las diferentes fases implicadas: masas sólidas, aceite y residuos; y (iv) Proponer una estrategia que permita evaluar la fijación de dietas con aceite de oliva como componente a partir de la determinación de ácidos grasos enlazados a triglicéridos y glicerofosfolípidos. La Memoria de Tesis se encuentra dividida en 7 capítulos. A continuación, se detalla el objetivo de cada uno: - Capítulo 1: Determinar el contenido de compuestos fenólicos en AOV(E)s obtenidos de productores durante dos campañas agronómicas para conocer la influencia de determinados factores agronómicos y geográficos sobre dicha familia de compuestos. Este estudio fue aplicado con la finalidad de conocer el valor saludable de AOV(E)s producidos en el área Mediterránea [11]. - Capítulo 2: Interpretar la caída en contenido fenólico del AOV(E) en los 12 primeros meses desde su producción y evaluar la influencia del perfil fenólico inicial sobre la pérdida de valor saludable asociado a dicha familia de compuestos [12]. - Capítulo 3: Estudiar el comportamiento del perfil fenólico inicial sobre la degradación de esta familia de compuestos en AOV(E)s sometidos a fritura a 180ºC durante 90 min. Para abordar este objetivo se seleccionaron cuatro AOVEs monovarietales con diferente perfil fenólico inicial [13]. - Capítulo 4: Establecer una propuesta para la caracterización de glicerofosfolípidos en aceites vegetales basada en extracción en fase sólida (SPE) y cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas en tándem (LC–MS/MS). El método se aplicó a un conjunto de aceites vegetales refinados y a diferentes categorías de aceite de oliva para comparar el perfil cualitativo y cuantitativo de dicha fracción y como una posible aproximación para discriminar entre categorías de aceite de oliva atendiendo a calidad [14]. - Capítulo 5: Monitorizar dos familias de componentes bioactivos (fenoles y terpenos) en fases oleosas obtenidas en distintas etapas del proceso de producción de AOVE para dos variedades representativas en cuanto a perfil fenólico, ‘Arbequina’ y ‘Picual’. También se pretendió abordar el efecto del deshuesado del fruto utilizando como referencia el perfil bioactivo de las fases oleosas obtenidas de fruto intacto [15] - Capítulo 6: Monitorizar dos familias de componentes bioactivos (fenoles y terpenos) en agua residual, aceite, y fases sólidas obtenidas durante el proceso de producción de AOVE para dos variedades representativas en cuanto a perfil fenólico, ‘Arbequina’ y ‘Picual’, y su comparativa frente al contenido en el AOVE final. - Capítulo 7: Proponer una estrategia de análisis de fijación de dieta basada en consumo de aceite de oliva a partir de la determinación de ácidos grasos enlazados a triglicéridos y a glicerofosfolípidos con el fin de obtener dos visiones complementarias para evaluar dicha fijación [16]. 3.Conclusión Las conclusiones más destacadas de este trabajo, de acuerdo con los objetivos inicialmente propuestos, se resumen a continuación: 1) Evaluar la influencia de diferentes factores en el contenido fenólico del AOV(E) y, por tanto, sobre su valor saludable atendiendo a la declaración saludable recogida en el Reglamento Europeo 432/2012. i) Se ha caracterizado el contenido fenólico en 1239 muestras de AOV(E) procedentes directamente de productores y obtenidas en dos campañas agronómicas consecutivas para establecer su valor saludable en base a la declaración saludable incluida en el Reglamento Europeo 432/2012. Se pudo comprobar que 85% de las muestras analizadas tuvieron un contenido fenólico superior a 250 mg/kg, contenido establecido como límite para poder hacer uso de dicha declaración. ii) Se ha estudiado la influencia de factores agronómicos y geográficos tales como la variedad, la fecha de producción y la localización sobre la variabilidad en el contenido fenólico del AOV(E). De esta forma, se pudo caracterizar la variabilidad en contenido fenólico asociada a estos tres factores, destacando por su especial relevancia la variedad y la fecha de producción. iii) La disminución en el contenido fenólico del AOV(E) durante su almacenamiento en condiciones ideales (temperatura ambiente y en material de vidrio opaco) depende del perfil fenólico inicial. La predominancia de determinados fenoles tales como oleaceína y oleocantal incrementa la caída en concentración fenólica tras 12 meses de almacenamiento. Además, se comprobó que la concentración de hidroxitirosol y ácido oleocantálico aumentaron después del almacenamiento pudiendo considerarse como marcadores de deterioro de AOV(E). iv) Se ha estudiado el deterioro del valor saludable de AOVEs sometidos a fritura a 180 ℃durante 90 min. Se encontró un patrón de correlación en la degradación oleomisional/oleocoronal con el aumento de la concentración de oleaceína/oleocantal. Además, la concentración del ácido oleocantálico aumentó, destacando de nuevo como posible marcador de alteración del aceite. 2) Caracterizar la fracción de glicerofosfolípidos en diferentes categorías de aceite de oliva y en otros aceites vegetales refinados aprovechando la combinación entre sensibilidad y selectividad del analizador de triple cuadrupolo. v) Se ha propuesto un método para la determinación cualitativa y cuantitativa de glicerofosfolípidos en aceites vegetales mediante LC−MS/MS con una extracción en fase sólida previa para aislar de forma selectiva dicha fracción. Como prueba de concepto, el método fue aplicado a muestras de aceite de oliva de diferentes categorías y se encontraron diferencias cuali- y cuantitativas en el perfil de glicerofosfolípidos, dando lugar a su propuesta como método para el control de calidad del producto. 3) Estudiar el comportamiento de dos familias de componentes bioactivos del AOVE (fenoles y triterpenos) durante el proceso de extracción de este a partir del análisis de las diferentes fases implicadas: masas sólidas, aceite y residuos. (vi) El deshuesado del fruto puede afectar al contenido fenólico del AOVE producido y, por tanto, a su valor saludable. Este efecto puede depender de la variedad como se deduce de la comparativa de resultados entre ‘Arbequina’ y ‘Picual’. Así, se vio que el deshuesado reduce el contenido fenólico en ‘Arbequina’ mientras que no afecta en ‘Picual’. En cuanto a componentes individuales, el deshuesado en ‘Arbequina’ dio lugar a AOVE con un contenido significativamente menor en isómeros agliconas de oleuropeína y ligustrósido que en el mismo producto obtenido a partir de fruto intacto. (vii) El proceso de extracción del AOVE juega un papel clave en la distribución de componentes bioactivos entre las fases implicadas. La caracterización de estas fases, concretamente, pastas, AOVE y residuos, resulta clave para la propuesta de mejoras tecnológicas que pudieran mejorar el enriquecimiento de estos componentes en AOVE. En el estudio planteado se pudo ver que los secoiridoides fueron extraídos preferentemente al AOVE, aunque el enriquecimiento en términos relativos fue superior en ‘Arbequina’ que en ‘Picual’. Los lignanos no se detectaron cuantitativamente en los residuos (alperujo y aguas de vegetación) mientras que los ácidos terpénicos y los flavonoides se encontraron mayoritariamente en los residuos, destacando, por tanto, su reducida transferencia al AOVE final. 4) Proponer una estrategia que permita evaluar la fijación de dietas con aceite de oliva como componente a partir de la determinación de ácidos grasos enlazados a triglicéridos y glicerofosfolípidos. (viii) Se ha desarrollado un método para la determinación del perfil de ácidos grasos enlazados a glicerofosfolípidos utilizando SPE y GC−MS. Con este método se consigue aislar esta fracción lipídica polar y, por tanto, la derivatización por transesterificación se produce de forma selectiva en estos compuestos. Con este método, se planteó una estrategia doble para monitorizar la fijación de dietas en función de su perfil graso, consistente en un doble análisis: por un lado, del perfil de ácidos grasos convencional (representativo de triglicéridos y ésteres de colesterol) y, por otro, del perfil enlazado a glicerofosfolípidos. De esta forma, se puede evaluar la fijación dietética a corto y largo plazo. 4. Bibliografía [1] M. Guasch-Ferre, F.B. Hu, M.A. Martinez-Gonzalez, M. Fito, M. Bullo, R. Estruch, E. Ros, D. Corella, J. Recondo, E. Gomez-Gracia, M. Fiol, J. Lapetra, L. Serra-Majem, M.A. Munoz, X. Pinto, R.M. Lamuela-Raventos, J. Basora, P. Buil-Cosiales, J.V. Sorli, V. Ruiz-Gutierrez, J.A. Martinez, J. Salas-Salvado, Olive oil intake and risk of cardiovascular disease and mortality in the PREDIMED Study, Bmc Medicine 12 (2014). 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