Estrategias bioanalíticas avanzadas para la caracterización cuantitativa de biomoléculas y nanopartículas

Resum

La cuantificación absoluta de biomoléculas es uno de los principales desafíos actuales en distintas ramas de las Ciencias de la Vida. Esta información es clave en clínica a la hora de llevar a cabo el diagnóstico y pronóstico de diversas patologías, revelando alteraciones del estado biológico de los organismos. De particular importancia es la cuantificación de posibles biomarcadores de ciertas enfermedades, entendiendo como biomarcador cualquier molécula o compuesto químico que pudiera indicar la existencia de patologías o procesos relacionados con las mismas. Uno de los principales problemas a la hora de llevar a cabo dicha cuantificación se debe a los niveles extremadamente bajos de concentración en los que se encuentran los biomarcadores, especialemente en etapas tempranas de una enfermedad, momento en el que su determinación permitiría un diagnóstico precoz. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar metodologías bioanalíticas con una sensibilidad suficiente para estas aplicaciones. Los avances en la espectrometría de masas elemental (ICP-MS) la han convertido en una alternativa viable para la cuantificación absoluta de biomoléculas, ya sea a través de la monitorización de los elementos que se encuentran presentes de forma natural en su estructura, de los heteroátomos añadidos artificialmente, o de la unión de estos heteroátomos a elementos de reconocimiento (como es el caso de los inmunoensayos). Adicionalmente, el crecimiento exponencial que ha experimentado la nanotecnología ha dado lugar a la síntesis de distintos tipos de nanopartículas (NPs) con excelentes propiedades optoelectrónicas, que han sido ampliamente explotadas como marcas de extraordinario valor en el desarrollo de métodos analíticos para la cuantificación absoluta de biomoléculas. Además de los biomarcadores proteicos bien reconocidos, las NPs en sí mismas pueden ser un marcador de contaminación medioambiental: dado el aumento de la utilización de estos materiales como aditivos en multitud de productos de uso cotidiano, la acumulación de NPs en el medioambiente es una realidad. Por tanto, se requieren metodologías analíticas para la determinación de los efectos tóxicos de las mismas en organismos vivos, así como para llevar a cabo una caracterización cuantitativa de la cantidad de NPs presentes en el medio. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de estrategias analíticas para la cuantificación absoluta de biomoléculas de interés biológico y de NPs inorgánicas empleado ICP-MS y técnicas ópticas. En los Capítulos 1 y 2 se ha evaluado el potencial y las limitaciones del ICP-MS como herramienta para la cuantificación absoluta de biomoléculas y de NPs sin necesidad de patrones específicos. Para ello, se ha llevado a cabo la comparación estadística de los factores de respuesta de 13 biomoléculas distintas y unos Quantum Dots (QDs) de CdSe/ZnS, utilizando 3 sistemas de nebulización diferentes. Se ha evaluado también la influencia de las distintas condiciones de nebulización sobre los factores de respuesta de los analitos, como el flujo de gas de nebulización, la temperatura de la cámara de nebulización, el flujo de líquido portador o el contenido salino. Finalmente, gracias a la capacidad multielemental del ICP-MS, se han podido validar los resultados obtenidos para los factores de respuesta de una de las biomoléculas, a través de la medida de otro heteroátomo presente en su estructura. En el Capítulo 3 se ha desarrollado un inmunoensayo para la detección ultrasensible de un reconocido biomarcador de cáncer, el antígeno prostático específico (PSA), a través de una detección óptica sencilla y rápida mediante microscopía Confocal de reflexión, en el mismo soporte sólido sobre el que se realiza el inmunoensayo. Para conseguir esta sensibilidad se han empleado QDs de ZnS dopados con Mn como marcas ancladas a un anticuerpo específico, y se ha recurrido a la deposición catalítica de Au sobre la superficie de los QDs, obteniendo así unas partículas de mayor tamaño (en el rango de los µm) visibles en el microscopio. En el Capítulo 4, se ha comparado el comportamiento citotóxico de NPs de HgSe solubles en medio acuoso frente a otras especies tóxicas de Hg ampliamente estudiadas (Metilmercurio y Hg inorgánico) tras su exposición en cultivos celulares humanos. Se ha determinado la viabilidad celular en dos líneas celulares tras su exposición a los tóxicos, evaluando la influencia de distintas concentraciones y tiempos de incubación. Gracias a la fluorescencia intrínseca de las NPs se ha estudiado su capacidad de penetrar en el interior de las células y su localización en el interior de las mimas. Por último, se ha determinado de forma cuantitativa la cantidad de Hg internalizada en función de la especie de Hg añadido en cada línea celular.