Análisis de pequeñas estructuras mediante icp-msdesarrollo metodológico y aplicaciones

  1. Álvarez-Fernández García, Roberto
Supervised by:
  1. Jörg Bettmer Director
  2. María Montes Bayón Director

Defence university: Universidad de Oviedo

Fecha de defensa: 30 October 2020

Committee:
  1. Elisa Blanco González Chair
  2. Ángel Manteca Fernández Secretary
  3. Maria Yolanda Madrid Albarran Committee member
  4. Cristina Sánchez González Committee member
  5. Carsten Engelhard Committee member

Type: Thesis

Teseo: 640642 DIALNET lock_openRUO editor

Abstract

Dos células producidas a partir de la misma célula precursora durante la mitosis pueden mostrar diferencias en sus genomas, transcriptomas y proteomas después de varias divisiones. Esta heterogeneidad puede ser la causa de diferentes enfermedades y se puede apreciar en muchos aspectos de la célula, entre los que se encuentra su composición elemental. En este sentido, los metales desempeñan un papel clave en importantes procesos biológicos como la expresión génica o en mecanismos catalíticos. Por ello, el desarrollo de estrategias analíticas que permitan el estudio de la variación del metaloma en células individuales es de vital importancia en campos como la biotecnología o la farmacología. En este aspecto, debido a los grandes avances en la sensibilidad y la mejora en cuanto a límites de detección, la espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) se postula como una excelente candidata para el análisis de pequeñas estructuras a nivel individual. La caracterización de nanopartículas metálicas individuales mediante el método single particle ICP-MS ha servido como punto de partida para el análisis de células individuales, un área de investigación muy activa en la que se puede apreciar un especial interés en el desarrollo de sistemas para la introducción de muestras a la fuente de ionización que mejoren la eficiencia de transporte de dichas estructuras al plasma. Por todo ello, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de metodologías analíticas basadas en ICP-MS para el análisis de pequeñas estructuras como células y nanopartículas de forma individual. Para ello, se han utilizado equipos de ICP-MS con distintos analizadores de masa equipados con diferentes sistemas de introducción de muestra, fundamente aquellos basados en la nebulización neumática, persiguiendo un aumento en la eficiencia de transporte respecto a los sistemas convencionales. Estos se han utilizado en diferentes tipos de aplicaciones que implican diferentes modelos celulares, desde células humanas hasta levaduras o bacterias. Por un lado, se ha evaluado el contenido intracelular de elementos constitutivos de las células como el cobre o el fósforo, así como la incorporación celular de metalofármacos como el cisplatino o nanopartículas metálicas en cultivos celulares. Por otro lado, se han desarrollado estrategias que han permitido investigar la formación de nanopartículas biogénicas en las células tras su lisis, o la degradación de nanopartículas metálicas en tejidos animales tras su administración por vía intraperitoneal en el animal. Los resultados más importantes de estos estudios se resumen a continuación: • Se ha desarrollado y optimizado un sistema de introducción de muestra mediante nebulización neumática para la introducción de células individuales. Tras su caracterización utilizando células tratadas con un complejo de Tb-DTPA, se ha aplicado a la evaluación cuantitativa de la incorporación de cisplatino en células de cáncer de ovario sensibles y resistentes al fármaco (A2780 y A2780cis, respectivamente), permitiendo distinguir directamente entre ambas líneas celulares. El mismo sistema permitió evaluar el contenido de cobre en esporas individuales de la bacteria Streptomyces coelicolor. • Se ha utilizado un sistema de introducción de células de alta eficiencia (High-Efficiency Cell Introduction System, HECIS) en un ICP-MS con analizador de tipo triple cuadrupolo para estudiar la incorporación de selenio en células individuales de levaduras crecidas en medios de cultivo enriquecidos con diferentes formas de este elemento. Tras la ruptura mecánica de las células, este mismo sistema junto con otras técnicas complementarias como HPLC-ICP-MS y TEM, han permitido investigar la presencia de nanopartículas biogénicas de selenio en las células de levadura con un amplio rango de tamaños. • Estas tres técnicas complementarias (SP-ICP-MS, HPLC-ICP-MS y TEM) se han aplicado al estudio de la degradación de nanopartículas de oro estabilizadas con citrato en hígado de rata, tras su inyección por vía intraperitoneal en el animal. • Se ha desarrollado una metodología basada en el uso de un ICP-MS con analizador de tiempo de vuelo (TOF) que ha permitido comparar la incorporación de nanopartículas de oro con diferente recubrimiento en células individuales de adenocarcinoma colorrectal humano. El uso de este analizador de masas ha permitido distinguir entre nanopartículas libres y asociadas a las células. Paralelamente, se ha evaluado la citotoxicidad de las nanopartículas utilizadas y su impacto en el metaboloma celular a través de un experimento de metabolómica dirigida basado en una separación por cromatografía de interacción hidrofílica con detección por espectrometría de masas de alta resolución, utilizando un espectrómetro de masas tipo orbitrap con fuente de electrospray (HILIC-HR-MS).