Aplicación de lipasas microbinanas para la producción de biocombustibles similares al biodiésel que integran la glicerina en forma de monoglicérido

Resumen

Resumen de la tesis doctoral de D. Carlos Luna Durán 1. Introducción o motivación de la tesis Investigaciones anteriores de nuestro Grupo han descrito la obtención de un nuevo tipo de biocombustible alternativo al Biodiésel convencional, denominado ECODIÉSEL, patentado por la universidad de Córdoba (Caballero et al., 2009, Verdugo et al., 2011, Verdugo et al., 2010). Este biocombustible, al igual que el biodiésel, es aplicable a los motores diésel convencionales pero tie- ne la particularidad de que integra el glicerol en forma de monoglicérido (MG). Esta innovación se considera muy útil y ventajosa, pues la glicerina aparece como un subproducto en la producción convencional del Biodiésel, que se acumula como excedente industrial, presenta una gestión pro- blemática, ya que su purificación resulta relativamente costosa y las elevadas cantidades produci- das no permiten su consumo, como materia prima en la fabricación de productos demandados por el mercado. Esto ha generado que en la actualidad ya se considere esta glicerina más como un resi- duo que como un producto aprovechable como una materia prima industrial (Calero et al., 2015, Luna et al., 2014d). Además, su presencia en el biocombustible, aún en cantidades muy pequeñas, es dañina para los motores de combustión, por lo que el proceso de producción de biodiésel convencional in- cluye un paso adicional de limpieza del biocombustible obtenido, dirigido a la eliminación de la gli - cerina, hasta unos niveles inferiores al 0.02%, según marcan las normas internacionales de calidad (Demirbas, 2009). Así, esta propuesta alternativa, cuánto menos conlleva una importante reduc- ción de los costes del proceso y mejora del rendimiento. El Ecodiésel es obtenido mediante tran- sesterificación enzimática con lipasas 1,3 selectivas: ya sea con la Lipasa Pancreática Porcina (PPL), inicialmente aplicada, o con diversas lipasas microbianas, que se han utilizado recientemente para seguir optimizando este proceso en estudio (Luna et al., 2014a, Luna et al., 2014b, Escobar-Nino et al., 2014, Luna et al., 2014c). En esta Memoria se recogen los trabajos realizados para avanzar en la optimización de este proceso enzimático, implementando así su viabilidad económica para la aplicación de nuevos bio- catalizadores lipásicos en la producción de Ecodiésel. En este sentido, la mayor novedad y progreso previsto en este trabajo es superar el principal problema asociado a la producción enzimática de Biodiésel, derivado del elevado costo de las enzimas de elevada pureza hasta ahora empleadas, dado que son complicadas de conseguir a partir de cepas obtenidas por técnicas genéticas y bio- tecnológicas, y sobre todo de su posterior purificación. Este trabajo de investigación plantea un es- tudio, evaluación y selección de diferentes lipasas, así como de diferentes sistemas enzimáticos ob- tenidos a partir de ellas, tanto en forma libre como inmovilizada, muy purificadas comerciales o ex- tractos poco purificados a partir de cepas silvestres, aisladas en medios lipófilos (aceite vegetal y grasa animal). También se prueban extractos procedentes de cepas, de la misma especie que una de las lipasas comerciales más habituales y productivas en este proceso como es la Candida an- tarctica tipo B (CALB) adquiridas en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo), a fin de seleccio- nar las lipasas o sistemas enzimáticos más eficaces, para optimizar la producción del biocombusti- ble indicado, así como su desarrollo biotecnológico, para su futura aplicación a escala comercial, a fin de posibilitar el desarrollo tecnológico de un sistema sostenible de producción de biocombusti- bles (Escobar-Nino et al., 2014). 2. Contenido de la investigación Como objetivo general, se pretende optimizar la producción del biocombustible Ecodiésel aplicando un proceso de etanolisis selectiva por vía enzimática, tanto evaluando diferentes siste- mas lipásicos, como determinando los parámetros más influyentes (y sus valores óptimos) en el rendimiento de las reacciones de transesterificación evaluadas. Este proceso biotecnológico se pre- senta como alternativa a los procesos químicos convencionales, ya que pretende ser más respetuo- so con el medio ambiente y a la vez más rentable desde el punto de vista económico que los proce- sos enzimáticos hasta ahora investigados. En este sentido, en este trabajo de investigación se abordan varias líneas para conseguir este objetivo: ¿ Evaluación y estudio de una lipasa de bajo costo, habitualmente usada en la industria ali- mentaria, como emulgente en la panificación. Se trata de la "Lipopan 50 BG" de Novozymes (obtenida a partir de una cepa genéticamente modificada de Aspergilus niger, siendo la fuente inicial Thermomices lanuginosus). La elección de este preparado enzimático viene motivado por ser económicamente asequible y encontrarse disponible en el mercado, para poder fácilmente aplicarlas en nuestro ámbito, la producción enzimática de biodiésel. ¿ Estudio y optimización de las condiciones y parámetros de reacción de una de las lipasas comerciales más habitualmente aplicada en la producción enzimática de biodiésel, la CALB (Candida antarctica tipo B) en diferentes sistemas o modalidades: a. "N435" (Candida antarctica tipo B o CALB recombinante, expresada en Aspergillus niger, inmovilizado en resina acrílica macroporosa) de Novozymes, que nos servirá como punto de partida y como referente a tener en cuenta respecto a los condicio- nes estándar para los subsecuentes estudios con variadas y diferentes lipasas. b. Evaluación de la lipasa CALB comercial inmovilizada por adsorción física en soportes inorgánicos; concretamente en materiales Mesoporosos Organosilíceos Ordenados (PMO) y material silíceo amorfo MS-3030 funcionalizado con grupos octilo anclados. c. Evaluación de extractos procedentes de una cepa estándar, de la misma especie, la Candida antarctica tipo B (CALB) adquiridas en la CECT (Colección Española de Culti- vos Tipo). Estos extractos son obtenidos a partir de cultivos líquidos, mediante liofi- lización con diálisis previa, se trataría de un método de purificación más simple (y ¿ económico) que los sistemas comerciales, muy purificados. Búsqueda, evaluación y selección de cepas microbianas silvestres en ambientes lipófilos (ri- cos en aceite vegetal y grasa animal), que presumiblemente poseerían lipasas 1,3-selectivas muy eficaces, capaces de realizar reacciones de transesterificación selectivas, útiles en la síntesis del Ecodiésel, biocombustible de segunda generación. Independientemente, del sistema enzimático investigado, van implícitos los siguientes obje- tivos: ¿ Obtención de un biocombustible exento de glicerina y con una viscosidad adecuada para su uso en motores diésel, puro o en mezclas con diésel de origen fósil. ¿ Optimización de los parámetros de la reacción de alcoholisis con etanol para la obtención de un biocombustible con las características antes enunciadas. ¿ Aplicación de un método analítico rápido y fiable, basado en la cromatografía de gases, para la caracterización de los productos obtenidos en la reacción de la alcoholisis parcial de triglicéri- dos, consistente en mezclas de FAEEs, MGs y DGs, en proporciones variables. Para alcanzar los objetivos anteriormente detallados, se puede diferenciar los siguientes apartados que conformarían los contenidos de la investigación: 1. Estudio, evaluación y optimización de las condiciones y parámetros de reacción de transeste- rificación del preparado enzimático comercial de Novozymes "Lipopan 50 BG" (lipasa obteni- da a partir de una cepa genética modificada de Aspergilus niger, siendo la fuente inicial Ther- momices lanuginosus). Se realizó un estudio de optimización univariable (OVAT) con esta lipasa comercial, que ha- bitualmente se utiliza como emulsionante en la industria panificadora. Se trata de un prepara- do enzimático de bajo costo que nunca se ha aplicado como biocatalizador en ningún proceso químico, así se ha elegido como tal en este proceso, con el fin de mejorar la viabilidad econó- mica del proceso de producción de biocombustibles. Los resultados obtenidos, en cuanto a los parámetros más influyentes en el rendimiento y sus valores óptimos, servirán como referencia para comparar resultados, con otras lipasas e incluso para desarrollar propuestas de inmoviliza- ción. 2. Estudio, evaluación y optimización de las condiciones y parámetros de reacción de la lipasa CALB (Lipasa tipo B de Candida antarctica) obtenida en diferentes sistemas o modalidades de purificación: 2.1."N435" (Candida antarctica tipo B o CALB recombinante, expresada en Aspergillus niger, inmovilizado en resina acrílica macroporosa). Se trata de un sistema catalítico comercial, a base de CALB, que aunque no es novedad su aplicación como biocatalizador para la producción de biodiésel enzimático convencional, en este trabajo de tesis doctoral es evaluado en una nueva aplicación, como es comprobar su via- bilidad en la producción de Ecodiésel, mediante un proceso 1,3 selectivo. También como ele- mento de referencia para otros estudios efectuados con diferentes sistemas catalíticos basados en lipasas CALB. Para efectuar el proceso de optimización multivariable es empleada la Meto- dología de Superficie de Respuesta (RSM) para estimar los principales parámetros que afectan al rendimiento de la reacción de transesterificación 1,3-selectiva, se determinarán las condicio- nes óptimas para lograr valores apropiados de viscosidad y conseguir elevada selectividad y conversión aplicando un diseño multifactorial de experimentos con tres factores (temperatura de reacción, relación aceite/etanol y alcalinidad del medio de reacción) usando el software Stat Graphics® "Centurion XV.I." También se comprobará la evolución del rendimiento de la reacción a lo largo del tiempo de reacción y la vigorosidad del sistema biocatalítico, al efectuarse varios ciclos de reacción sucesi- vos. 2.2 Lipasa CALB inmovilizada en otros soportes inorgánicos . Evaluación de la lipasa CALB comercial inmovilizada en otros soportes inorgánicos, concre- tamente materiales Mesoporosos Organosilíceos Ordenados (PMO) y material silíceo amorfo MS-3030 funcionalizado con grupos octilo anclados, como sistema biocatalítico en la reacción de etanolisis del aceite de girasol para producir Ecodiésel (FAEE + MG). También se comprobó la evolución del rendimiento de esta reacción a lo largo del tiempo de reacción y la vigorosidad del sistema biocatalítico, al efectuarse varios ciclos de reacción sucesivos. 2.3. Cepa estándar de Candida Antarctica procedente de la CECT (Colección Española de Cul- tivos Tipo). En este apartado se realizaron diversos estudios encaminados a dilucidar las condiciones óptimas de crecimiento y la capacidad transesterificadora de una cepa estándar adquirida en la C.E.C.T. (Colección Española de Cultivos Tipo). Se evaluó el comportamiento catalítico de extractos enzimáticos obtenidos a partir de culti- vos líquidos de una cepa estándar de CALB, para compararlos con las enzimas comerciales procedentes de la misma especie de microorganismo. Así, realizamos un estudio para deter- minar las condiciones óptimas de cultivo del microorganismo (medio de cultivo, temperatura, tiempo de cultivo, etc). A través de un proceso de liofilización y diálisis previa de los cultivos lí- quidos, son obtenidos los extractos enzimáticos, que son aplicados como biocatalizadores en las correspondientes reacciones de transesterificación 1,3-selectivas, comprobándose así su viabilidad y estabilidad. También se evaluará la evolución del rendimiento de la reacción a lo largo del tiempo de reacción y la vigorosidad del sistema biocatalítico, al efectuarse varios ci- clos de reacción sucesivos. 3. Búsqueda, evaluación y selección de cepas microbianas silvestres en ambientes lipófilos (ri- cos en aceites vegetales o en grasas animales), con lipasas 1,3-selectivas eficaces, capaces de realizar reacciones de transesterificacion útiles en la síntesis de biocombustibles de segunda generación. Tras realizar la correspondiente recogida de muestra de un número elevado de cepas, tanto en ambientes lipófilos de origen vegetal ("almazara de aceite de oliva") y de origen animal ("se- rrín de pescado y grasa de jamón"), se aplicarán técnicas de "screening" para comprobar cuáles presentan actividad biocatalítica de transesterificación, de las que se seleccionarán las más efi- caces. A partir de sus cultivos líquidos se obtendrán los correspondientes extractos enzimáti- cos, mediante un proceso que consta de una diálisis previa y liofilización. Estos extractos fueron evaluados en la reacción de transesterificación 1,3-selectiva con etanol, comprobándose la evolución del rendimiento de reacción en el tiempo, y también su estabilidad, a través de la re- petición de varios ciclos de reacciones. Se procederá a la caracterización de las cepas más efica- ces, mediante un análisis filogenético basado en la técnica del ARNr 16S determinando el Gé- nero y especie de las mismas. También se estudiarán los medios y condiciones de cultivo ópti- mos para producir los extractos con actividades lipásicas más eficaces. 3. Conclusiones Con la presente investigación se pretende posibilitar la producción eficiente mediante catá- lisis enzimática de un biocombustible, el Ecodiésel, capaz de sustituir, total o parcialmente, al dié- sel fósil en los motores actuales, sin realizar modificación alguna en los mismos, evitando los incon- venientes medioambientales que lleva asociada la producción del biodiésel convencional, al tratar de satisfacer las exigencias de la norma EN 14214. En este sentido, en base a la metodología enzimática patentada por la universidad de Cór- doba, que evita la producción del glicerol, en el proceso de obtención del biocombustible, mante- niéndolo en forma de monoglicérido, se ha realizado el trabajo experimental de la presente Tesis Doctoral. El objetivo de estas investigaciones se ha dirigido a implementar la viabilidad técnica y económica de este proceso, mediante la aplicación de diversos biocatalizadores constituidos por li- pasas comerciales, tanto en forma libre como soportada y de diversos extractos enzimáticos lipási- cos, obtenidos a partir de cultivos microbianos líquidos, tanto de cepas silvestres como una están- dar de CALB. Los principales resultados experimentales y las conclusiones obtenidas al respecto, como consecuencia de las investigaciones realizadas, se detallan a continuación: ¿ Se han conseguido optimizar Las condiciones de reacción de etanolisis de aceite de girasol para hacer posible la producción de un biocombustible que no genera glicerol, el Ecodiésel, median- te el uso de los diferentes biocatalizadores enzimáticos investigados, que al actuar de forma 1,3 selectiva integra el glicerol como monoglicérido. ¿ Se han evaluado, con resultados altamente adecuados, desde el punto de vista técnico, los bio- catalizadores lipásicos: Lipopan 50 BG; CALB N435; CALB comercial inmovilizada en forma no covalente en soportes inorgánicos, en materiales Mesoporosos Organosilíceos Ordenados (PMO) y sobre material silíceo amorfo MS-3030 funcionalizado con grupos octilo fijados al so- porte mediante reactivos organosilanos; extractos enzimáticos obtenidos a partir de cultivos lí- quidos, tanto de una cepa estándar CALB de la C.E.C.T. (Colección Española de Cultivos Tipo) como de cepas silvestres recolectadas en ambientes lipófilos (ricos en aceites vegetales o gra- sas animales). ¿ Se ha demostrado la viabilidad de todas las lipasas evaluadas, comprobándose en todos los ca- sos que la presencia de una mínima cantidad de disolución acuosa 12N de NaOH (0.2 % respecto al aceite) es fundamental para conseguir que se lleve a cabo el proceso de transesterificación enzimática 1,3 selectiva. Es decir, la acción biocatalítica se debe a la importante activación que experimentan las diferentes lipasas investigadas y por la acción de mínimas cantidades de la disolución acuosa de NaOH muy concentrada. ¿ Se ha puesto a punto un procedimiento cromatográfico que permite identificar y cuantificar de forma eficiente los diferentes componentes de la mezcla de reacción: FAMEs o FAEEs, y los co- rrespondientes monoglicéridos, que constituyen los biocombustibles propuestos, a la vez que se puede confirmar la ausencia de glicerol en los productos de la reacción obtenidos, en las condiciones de operación investigadas. ¿ En todos los casos ensayados, de todos los biocatalizadores propuestos, se obtienen rendi- mientos suficientemente eficaces en reacciones sucesivas y a lo largo del tiempo de reacción, que demuestran su potencial biotecnológico y su presumible viabilidad técnica a nivel indus- trial. ¿ A la luz de los resultados obtenidos se pueden considerar para cada biocatalizador, una serie de puntos fuertes y debilidades: o Lipopan 50 BG (Novozime®), lipasa comercial de bajo costo extraída de Thermomyces lanuginosus e insertada en Aspergillus oryzae. Los estudios de optimización OVAT, muestran que las condiciones óptimas para la realización de las reacciones de etanolisis 1,3-selectivas, requieren sólo una mínima cantidad de disolución acuosa de sosa y de lipasa, (0.01 ml de NaOH 10 N y 0.01 g, respectivamente, para los volúmenes de reactivos optimizados: 6 ml aceite de girasol comercial, 1.75 ml de Etanol absoluto), operando prácticamente a temperatura ambiente (30 oC). El único problema asociado con esta lipasa comercial es su uso en forma homogénea y por tanto la imposibilidad para ser reutilizada. o Novozym 435 (CALB), un preparado comercial de la levadura Candida antarctica, re- combinante, expresada en el hongo Aspergillus niger e inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa. Los estudios de optimización realizados mediante una metodolo- gía ANOVA, que ha proporcionado modelos estadísticos para predecir con suficiente exactitud la Conversión, Selectividad y la Viscosidad cinemática, en función de las varia - bles de entrada Temperatura, mínimas cantidades de disolución acuosa NaOH 10N y la ratio aceite/alcohol. El principal inconveniente de este biocatalizador comercial es su baja estabilidad cuando se emplea en un medio tan liposoluble como los aceites o los productos de su transesterificación, donde se emulsionan convirtiéndose en un mate- rial gelatinoso muy incómodo para trabajar en las reutilizaciones sucesivas, que hace necesario la centrifugación de los productos de reacción para conseguir la recuperación del catalizador. Esta etapa de centrifugación adicional puede constituir un inconvenien- te importante para su aplicación en un proceso a escala industrial. o CALB comercial, inmovilizada en forma no covalente en soportes inorgánicos, en mate- riales Mesoporosos Organosilíceos Ordenados (PMO) y sobre material silíceo amorfo MS-3030 funcionalizado con grupos octilo fijados con reactivos organosilanos. Se com- prueba como el soporte MS-3030 presenta mejores rendimientos, aunque sucede el mismo fenómeno que con la N435, el sistema biocatalítico se emulsiona tras la primera reacción de etanolisis, por lo que se hace necesario centrifugar los productos de reac- ción para recuperar el biocatalizador y posibilitar sus sucesivas reutilizaciones. o Extracto enzimático obtenido a partir del cultivo líquido de una cepa estándar de CALB procedente de la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo). Tras la optimización del medio y condiciones de cultivo de la cepa para conseguir extractos eficaces, se demues- tra la viabilidad del uso de dichos extractos enzimáticos no purificados, obtenidos de forma sencilla, a partir de cultivos microbianos líquidos (simplemente mediante liofiliza- ción con diálisis previa) para su aplicación en el proceso de etanolisis selectiva condu- cente a la obtención de biocombustibles, sin generar glicerol como subproducto. La uti- lización de estos extractos enzimáticos puede abaratar de forma muy considerable la obtención de Ecodiésel, mediante este proceso. o Los extractos obtenidos a partir de cepas "silvestres" recolectadas en ambientes lipófi- los, ricos en aceites vegetales o grasas animales, han resultado igualmente eficaces que los obtenidos empleando la cepa estándar de CALB, cuando se aplican las mejores ce- pas obtenidas tras la realización de un amplio screening de estas cepas ¿silvestres¿. Igualmente, aplicando sus extractos poco purificados, obtenidos por liofilización con diálisis previa. o Se ha efectuado la caracterización de algunas de las cepas silvestres (Terribacillus, Baci- llus, etc.) con rendimiento elevado en la reacción de etanolisis para la producción de biocombustibles, lo que ha permitido solicitar una patente conjunta entre las Universi- dades de Córdoba y Sevilla, P201300039, con fecha de prioridad 11/01/2013, titulada ¿Cepa microbiana Terribacillus SP.AE2B 122 con capacidad para llevar a cabo reacciones de transesterificación y usos de las mismas¿. Los estudios del rendimiento en sucesivas reacciones y a lo largo del tiempo de reacción demuestran su potencial biotecnológico. ¿ Los resultados al emplear extractos enzimáticos, obtenidos a partir de cultivos líquidos de ce- pas de diferentes microorganismos, a través de una metodología sencilla, una liofilización con diálisis previa, ponen de manifiesto que es posible acceder a un material enzimático capaz de llevar a cabo el proceso de alcoholisis enzimática conducente a la síntesis de Ecodiésel, de una manera sencilla y económica, con resultados equiparables o incluso mejores, que los consegui- dos empleando las lipasas comerciales muy purificadas, las únicas actualmente disponibles en forma comercial, pero de un precio muy elevado, lo que necesariamente influirá en la viabili- dad económica del proceso de producción de Ecodiésel. ¿ Un elevado grado de pureza en un determinado preparado enzimático es imprescindible, si se quiere emplear en estudios bioquímicos, asociados a la acción de una enzima específica, sin riesgo de interferencia de otras enzimas presentes en el medio estudiado. Sin embargo, para la aplicación de las enzimas en procesos de química fina es más conveniente el empleo de extrac- tos enzimáticos muy poco purificados (y por tanto mucho más económicos) en los que, aunque se encuentren presentes un elevado número de otras enzimas capaces de actuar en procesos diferentes, no interferirán, ya que sólo podrán actuar las enzimas que encuentren los sustratos necesarios para participar en las reacciones enzimáticas. La presencia de otras enzimas no in- terferirán al no encontrar moléculas adecuadas para ello. ¿ La obtención de extractos enzimáticos poco purificados y de muy bajo costo pudieran consti- tuir un nuevo paradigma en lo que se refiere a la aplicación de las enzimas en Química Fina, ya que al contener un amplio espectro de enzimas, cabe la posibilidad de su aplicación en varios procesos enzimáticos diferentes. Queda así abierta la posibilidad de investigar otros usos de es- tos mismos extractos, en otros procesos de interés en Química Fina, promovidos por lipasas, o por otras enzimas que también pudieran estar presentes en los mismos. En lo que respecta al proceso de obtención de Ecodiésel empleando los extractos enzimáticos muy poco purificados y de bajo costo, se muestran especialmente eficientes en la obtención de procesos de etanólisis 1,3 selectivas, donde el glicerol se mantiene como MG en la mezcla de biocombustibles, junto con los diferentes FAEEs obtenidos, y con el exceso de etanol sin reaccionar. De esta manera, se consigue un nuevo tipo de biodiésel, el Ecodiésel, constituido por una mezcla de monoacilgliceroles y FAEEs principalmente (nominalmente 1/2), que se puede utilizar en diferentes mezclas con combustible diésel convencional, sin más separación o proceso de purificación. Este nuevo biocombustible también se puede obtener en tiempos de reacción cortos y en condiciones de reacción más suaves que las exigidas por el proceso químico convencional. Además, no sólo se consigue, respecto a la reacción biodiésel convencional, un rendimiento atómico comparativamente mayor (prácticamente 100%), no sólo porque no se genera glicerol como subproducto, sino porque se integran todos los reactivos empleados, incluido el etanol en exceso, lo que permite utilizarlo directamente tras de su producción. Summary of PhD report by Carlos Luna Durán 1. Introduction/Motivation of the PhD. Previous research works from our group have described the production of a new type of al- ternative biofuel to conventional biodiesel, called ECODIESEL, patented by the University of Cor- doba (Caballero et al., 2009, Verdugo et al., 2010, Verdugo et al., 2011). This new proposed biofuel, like the conventional biodiesel, is applicable to conventional diesel engines, but it has the particu- larity that integrates the glycerol as monoglyceride (MG). This innovation is considered very useful and advantageous, because the glycerol appears as a byproduct in the production of conventional biodiesel, which accumulates as an industrial excess. Besides, it has a problematic management because its purification is relatively expensive and the high quantities produced do not allow its consumption, as raw material in the manufacture of products demanded by the market. This has generated that currently the glycerol is already more considered as a waste than as an industrial raw material (Calero et al., 2015, Luna et al., 2014d). Furthermore, its presence in the biofuel, even in very small amounts, is harmful to combus - tion engines; so that the conventional production process of biodiesel includes an additional step of cleaning it from the biofuel produced, conducted to the total removal of the glycerol, lower lev- els up to 0.02%, according to what is indicated by the international quality standards (Demirbas, 2009). Thus, this alternative proposal, as less implies a significant reduction in process costs and improving performance. The Ecodiesel is obtained by enzymatic transesterification of triglycerides and short chain alcohols (ethanol) with 1, 3 selective lipases: either with porcine pancreatic lipase (PPL), initially applied in the original patent, or with various microbial lipases, which has recently been used to further optimize this studied process (Luna et al., 2014a, Luna et al., 2014b, Escobar- Nino et al., 2014, Luna et al., 2014c). In this thesis are collected all the performed works to further optimize this enzymatic process, thus implementing their economic viability to the application of new lipase biocatalysts in the production of Ecodiesel. In this sense, the greatest novelty and progress predicted through this research work is to overcome the usual associated inconvenient with the enzymatic production of biodiesel. It is derived from the high cost of the very much purified enzymes until now employed, since they are difficult to obtain from microorganisms, which were subjected to genetic and biotechnological techniques. This research work presents a wide study, evaluation and selection of different lipases and various enzyme systems obtained from them, in free or immobilized form, quite purified commercial or slightly purified extracts from wild strains, which were isolated from lipophilic environments (vegetable oil and animal /fats). Also, it is studied standard extracts from strains of the same species of commercial lipases. In this sense, one of the most common and pro- ductive lipase in this process, such as Candida antarctica type B (CALB) was chosen. This standard strain was obtained from the CECT (Type Microbial Cultures Spanish Collection) and was also tested. All these research works were developed in order to select the most effective lipases or en- zymatic systems to optimize the production of this proposed biofuel. As well as its biotechnological development, for future application to commercial scale, to enable and make viable the technolog- ical development of a sustainable system of biofuel production (Escobar-Nino et al., 2014). 2. Content of the research As an overall objective, it is pretended to optimize the production of the ECODIESEL biofuel, applying a process of enzymatic selective ethanolysis, both evaluating different lipase systems, as determining the most influential parameters (and their optimal values) in the yield of evaluated transesterification reactions. This biotechnologic process is presented as an alternative to conventional chemical processes, as it aims to be more environmentally friendly and more profitable from the economic point of view enzymatic than the enzymatic processes until now investigated. In this sense, this research addresses several lines to achieve this goal: ¿ Evaluation and study of a low cost lipase, commonly used in the food industry as an emulsifier in breadmaking. It is the "Lipopan 50 BG" Novozymes (obtained from a genetically modified strain of Aspergillus niger, being the initial source Thermomices lanuginosus). The choice of this enzyme preparation is motivated for being affordable economically and for being available in the market, so it can be easily applied in our ambit, the enzymatic production of biodiesel. ¿ Study and optimization of the conditions and reaction parameters of one of the commercial lipases most commonly applied in the enzymatic production of biodiesel, the CALB (Candida antarctica Lipase B) on different systems or procedures: a) "N435" (Candida antarctica lipase B or recombinant CALB expressed in Aspergillus niger immobilized in macroporous acrylic resin) from Novozymes, which will serve as a starting point and as a reference to keep in mind regarding to the standard conditions for subsequent studies with varied and different lipases. b) b. Evaluation of the commercial lipase CALB but immobilized by physical adsorption on inorganic supports; specifically Periodic Mesoporous Organosiliceous (PMO) and amorphous siliceous material MS-3030 functionalized with anchored octyl groups. c) Evaluation of extracts from a standard strain of the same species, Candida antarctica acquired in the CECT (Type Culture Spanish Collection). These extracts are obtained from broths by lyophilization with a previous dialysis, it would be a simpler method (and economic) than commercial purification systems, highly purified. ¿ Search, evaluation and selection of wild microbial strains in lipophilic environments (rich in vegetable oil and animal fat), which presumably would posses very effective 1,3-selective lipases, capable of performing selective transesterification reactions, useful in the Ecodiesel synthesis, a second generation biofuel. Regardless of the investigated enzyme system, it is implied the following objectives: ¿ Getting a free glycerol and with a suitable viscosity for its use in diesel engines, pure or blended with biodiesel or with fossil diesel. ¿ Optimization of alcoholysis reaction parameters with ethanol to obtain a biofuel with the characteristics before enunciated. ¿ Application of a fast and reliable analytical method, based on gas chromatography, for the characterization of the obtained products in the partial alcoholysis reaction of triglycerides, consisting in FAEEs, MGs and DGs mixtures, in varying proportions To achieve the objectives outlined above, it can be differentiated the following sections that would compose such contents of the research: 1) Study, evaluation and optimization of reaction conditions and parameters transesterification of commercial enzyme preparation of Novozymes Lipopan 50 BG "(lipase derived from a genetically modified strain of Aspergillus niger, being the initial source Thermomices lanuginosus). It was perfomed a study of univariate optimization (OVAT) with this commercial lipase, which is usually used as an emulsifier in the bakery industry. It is a low cost enzyme preparation that has never been applied until now as biocatalyst in any chemical process, so it has been chosen as such in this process, in order to improve the economic viability of the biofuel production process. Obtained results, in terms of the most influential parameters in yield and optimal values, serve as a reference to compare results with other lipases and even to develop proposed of immobilization. 2) Study, evaluation and optimization of reaction conditions and parameters of CALB (Candida antarctica Lipase B) obtained in different systems: 2.1. "N435" (Candida antarctica Lipase B or recombinant CALB expressed in Aspergillus niger immobilized on macroporous acrylic resin). This is a commercial catalyst system, CALB based, that although it is not a new application as biocatalyst for the conventional enzymatic biodiesel production , in this doctoral thesis is evaluated a new approach, such as checking its viability in the Ecodiesel production through a 1,3 selective process. It will also serve as a reference for other studies with different catalytic systems on lipase CALB based. To make the process of multivariable optimization is employed the Response Surface Methodology (RSM) to estimate the main parameters that affect the yield of the transesterification 1,3-selective reaction. Optimal conditions are determined to achieve the appropriate viscosity values and to get a high selectivity and conversion applying a multifactorial design of experiments with three factors (reaction temperature, oil / ethanol and alkalinity of the reaction medium) using the Stat Graphics® "Centurion XV.I." software. Also, it was checked the reaction yield evolution along the reaction time and the vigorousness of the biocatalytic system, when several successive reaction were made. 2.2. Commercial CALB immobilized on other inorganic supports. Evaluation of commercial CALB immobilized in others inorganic supports, particularly Periodic Mesoporous Organosilica (PMO) and amorphous siliceous material MS-3030 functionalized with anchored octyl groups, as biocatalytic system int the ethanolysis of sunflower oil reaction to produce Ecodiesel (FAEE + MG). It was also checked the evolution of the reaction yield along the reaction time and the vigorousness of the biocatalytic system when several successive reaction cycles were made. 2.3. Standard strain of Candida Antarctica from the CECT (Spanish Type Culture Collection). In this section, it was made several studies in order to elucidate the optimal growth conditions and transesterification capacity of a standard strain, acquired in the CECT (Type Culture Spanish Collection). It was evaluated the catalytic behavior of enzymatic extracts obtained from broths of a CALB standard strain, to make comparison with commercial enzymes from the same microorganism species. Thus, we conducted a study to determine the optimal conditions for cultivation of the microorganism (culture medium, temperature, culture time, etc). Through a process of lyophilization and a previous dialysis of broths are obtained the enzymatic extracts, which are applied as biocatalysts in the corresponding 1,3-selective transesterification reactions, checking its viability and stability. Besides, it was evaluated the reaction yield evolution along the reaction time and the vigorousness of the biocatalytic system, when several successive reaction cycles were made. 3) Search, evaluation and selection of wild microbial strains in lipophilic environments (rich in vegetable oils or animal fats) with effective 1,3-selective lipase, capable of performing useful transesterification reactions in the synthesis of second generation biofuels. After making the appropriate sample collection of a large number of strains, both in lipophilic environments of vegetal ("olive oil mill") and animal ("sawdust fish and ham fat") origin, it was applied "screening" techniques to check which exhibit biocatalytic transesterification activity, from them were selected the most effective. From their broths were obtained the corresponding enzyme extracts, by a process consisting of a previous dialysis and lyophilization. These extracts are evaluated in the 1, 3 selective transesterification reaction with ethanol, verifying the evolution of the reaction yield along the time, and its stability through several repeated cycles of reaction. It was proceeded to the characterization of the most effective strains, using a phylogenetic analysis, based on 16S rRNA technique, determining the genus and species of such strains. The mediums and conditions of optimal cultivation to produce the extracts with most effective lipase activities were also studied. 3. Conclusions With the present research work is pretended to enable the efficient production by enzy- matic catalysis of a biofuel, the Ecodiesel, capable to replace, totally or partially, the fossil diesel in current engines, without making any modification in them. In this way, avoiding environmental drawbacks that are associated to the conventional biodiesel production, since they are satisfied the requirements of EN 14214. In this respect, based on enzymatic methodology patented by the University of Cordoba, which avoids the glycerol production in the process of obtaining biofuel, keeping it as monoglyc - eride. So, it was performed the experimental work of this thesis. The aim of these researches has been directed to implement the technical and economic feasibility of this process, by applying vari- ous biocatalysts. These were constituted by commercial lipases, both free form as supported, and various enzymatic extracts obtained from microbial broths, either from wild strains or from a stan- dard CALB strain. The main experimental results and conclusions achieved as results of this re - search work are detailed below: ¿ It has been achieved to optimize reaction conditions of the ethanolysis of sunflower oil to make possible the production of a biofuel that does not generate glycerol as byproduct (Ecodiesel). Through using different tested heterogeneous enzymatic biocatalysts, since they are 1,3 selec- tive, integrate glycerol as monoglyceride. ¿ It has been evaluated, with highly appropriate results, from the technical point of view the li- pase biocatalysts: Lipopan 50 BG; N435 CALB; commercial CALB non covalently immobilized on inorganic supports, like over periodic mesoporous organosilica (PMO) and amorphous siliceous material 3030-MS functionalized by octyl groups attached to the support by organosilanes; en- zymatic extracts obtained from microbial broths, both of the standard CALB strain of the CECT (Type microbial Cultures Spanish Collection) as wild strains collected in lipophilic environments (rich in vegetable oils or animal fats). ¿ It has been demonstrated the viability of all the tested lipases, proving that in all cases the presence of a minimum amount of a NaOH 12N aqueous solution (0.2% of the oil) is essential to achieve the perform of the 1,3 selective enzymatic transesterification process. That is, the biocatalytic action is due to the significant activation experimented by the different tested li- pases and by the action of minimum quantities of highly concentrated NaOH aqueous solution. ¿ It has been developed a chromatography method that allows identifying efficiently the differ- ent components of the reaction mixture: FAMEs or FAEEs, and the corresponding monoglyc- erides, that constitutes the proposed biofuels, at the same time it can be confirmed the ab - sence of glycerol in the obtained reaction products, in the investigated operating conditions. ¿ In all tested cases, of all proposed biocatalysts, enough effective yields are obtained in succes- sive reactions and along the reaction time, demonstrating their biotechnological potential and technical presumed feasibility at an industrial level. ¿ From obtained results, it can be considered for each biocatalyst, a set of strengths and weak- nesses: o Lipopan 50 BG (Novozime®), a low cost commercial lipase extracted from Thermomyces lanuginosus and inserted into Aspergillus oryzae. OVAT optimization studies show that optimum conditions to conduct 1, 3-selective ethanolysis reactions require only a mini- mal amount of aqueous sodium hydroxide solution and of lipase (0.01 ml of 10N NaOH and 0.01 g, respectively, for the optimized reagent volumes: 6 ml of commercial sun- flower oil, 1.75 ml of absolute ethanol), operating at practically room temperature (30 °C). The only associated problem with commercial lipase is its use in homogeneous form and therefore it is unable to be reused. o Novozym 435 (CALB), a commercial preparation of the recombinant Candida antarctica yeast expressed in the Aspergillus niger fungus and immobilized onto a macroporous acrylic resin. Performed optimization studies by ANOVA methodology, has provided sta- tistical models to predict with sufficient accuracy the conversion, selectivity and Kine- matic viscosity, depending on the input variables temperature, minimal amounts of aqueous 10N NaOH solution and the oil/alcohol ratio. The main disadvantage of this commercial biocatalyst is its low stability when it is used in a liposoluble medium such as oils or transesterification products, where it is emulsified becoming in a gelatinous material very uncomfortable to work for the subsequent reuse. So that, it is required the centrifugation of the reaction products for the catalyst recovery. This additional cen- trifugation step could be an important inconvenient to its application in a process on an industrial scale. o Commercial CALB non covalently immobilized on inorganic supports, like over periodic mesoporous organosilica (PMO) and amorphous siliceous material 3030-MS functional- ized by octyl groups attached to the support by organosilanes reactives. It is checked as the 3030-MS support has better yields, although it happens the same phenomenon as with the N435, the biocatalytic system is emulsified after the first ethanolysis reaction, so it is necessary to centrifuge the reaction products to recover the biocatalyst and to make enable its subsequent reuse. o Standard CALB strain of the CECT (Type microbial Cultures Spanish Collection). After medium and culture conditions optimization of the strain to achieve effective extracts, the feasibility of using these unpurified easily obtained enzymatic extracts (simply by lyophilization with previous dialysis), from microbial broths is demonstrated. So that, its application in the selective ethanolysis process conducting to the biofuels obtention, without generating glycerol as byproduct. The use of these enzyme extracts can make considerably cheaper the obtaining of Ecodiesel through this process. o The obtained extracts from "wild" strains, collected in lipophilic environments rich in vegetable oils or animal fats, have proven to be equally effective as those obtained us- ing a CALB standard strain. Then, the best strains selected after performing an extensive screening of these "wild" strains. Similarly, applying their little purified extracts ob- tained by lyophilization with previous dialysis. o It has been made the characterization of some of the wild strains (Terribacillus, Bacillus, etc.) with high ethanolysis reaction yield of biofuels production, which allowed to get a patent between the universities of Cordoba and Seville, P201300039 with priority date 11/01/2013, entitled "Microbial Strain Terribacillus SP.AE2B 122 capable of carrying out transesterification reactions and uses thereof." Performance studies in successive reac- tions and along the reaction time demonstrate their biotechnological potential. o Regarding the obtained results using enzymatic extracts from different microbial broths, through a simple method, lyophilization with prior dialysis. They show that is possible to access to an enzymatic material capable of carrying out the enzymatic alcoholysis process to produce Ecodiesel, in a simple and economical way, with comparable or even better results than those achieved using highly purified commercial lipases. Which are the only currently available commercially biocatalyst, but in a very high price. This fact necessarily will influence the economic viability of the production process Ecodiesel. o A high degree of purity at a given enzyme preparation is essential, if it is wanted to em- ploy it in biochemical studies, associated to the action of a specific enzyme, without risk of interference from other present enzymes in the studied reaction medium. However, for the application of enzymes in fine chemical processes it is more advantageous to use little purified enzyme extracts (and hence more economical). In which, although a large number of other capable of acting enzymes are present in different processes, they will not interfere, because only the enzymes that find the substrates needed to participate in enzymatic reactions may act. The presences of other enzymes do not in- terfere, as they do not find suitable molecules for this. o Regarding the process of Ecodiesel obtention employing the little purified and inexpen- sive extracts. They show that are particularly efficient in obtaining the 1.3 selective ethanolysis processes where glycerol is kept as MG in the mixture of biofuel together with different obtained FAEEs and the excess of unreacted ethanol. Thus, it is achieved a new type of biodiesel, Ecodiesel, constituted by a mixture of monoacylglycerols and FAEEs (nominally 1/2), which can be used in different mixtures with diesel fuel, without further separation or purification process. This new biofuel can also be obtained in short reaction times and milder reaction conditions than those required by conven- tional chemical reaction process. Furthermore, it is not only achieved, respect to the conventional biodiesel reaction, a comparatively higher atomic yield (almost 100%). That is not only because no glycerol is produced as byproduct, also that all used reagents are integrated, including excess ethanol, which It allows to be used directly af- ter its production. 4. References Caballero, V., Bautista, F. M., Campelo, J. M., Luna, D., Marinas, J. M., Romero, A. A., Hidalgo, J. M., Luque, R., Macario, A. & Giordano, G. 2009. 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