Genómica funcional de la regulación y eficiencia de la asimilación de nitrógeno en chlamydomonas

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D. Francisco Javier Ocaña Calahorro 1. INTRODUCCION El óxido nítrico (NO) es una molécula de señal que interviene en multitud de procesos biológicos en todos los organismos vivos. Aunque se identificó en plantas, su importancia se ha puesto de manifiesto primero en animales, donde participa en el mantenimiento del tono vascular, la señalización celular y la respuesta inmune entre otros. En las últimas dos décadas se ha disparado el interés por esta molécula en organismos fotosintéticos debido a su papel en un amplio abanico de procesos biológicos. El NO tiene un papel relevante en el crecimiento de las plantas, regulación del metabolismo, y en procesos de defensa (Corpas, 2004; He et al., 2004; Neill et al., 2008; de Montaigu et al., 2010; Fernández- Marcos et al., 2011; Yun et al., 2011). En este trabajo se ha utilizado el alga Chlamydomonas como organismo modelo para estudiar la regulación negativa por óxido nítrico sobre transportadores de amonio, de nitrato/nitrito y de la nitrato reductasa, que intervienen en la ruta de asimilación de nitrógeno. Hemos estudiado el papel del óxido nítrico y su modo de actuación en los primeros pasos de la ruta. Además, hemos caracterizado hemoglobinas truncadas, entre ellas THB1, por su posible implicación en el metabolismo del NO en el alga. Chlamydomonas es un alga unicelular eucariota fotosintética y un modelo emergente para el estudio de gran cantidad de procesos biológicos, entre ellos el que aquí se propone. La asimilación de nitrato en una célula eucariótica fotosintética es un proceso aparentemente sencillo. Sin embargo, la regulación de esta ruta es extremadamente compleja y permite responder y adaptarse a las condiciones ambientales de diferentes fuentes de nitrógeno disponible, luz, carbono, otros nutrientes (Galván et al., 2006; Fernández y Galván, 2007). Nuestra hipótesis de partida fue que el óxido nítrico debe tener un papel clave en la regulación de la asimilación de nitrato, concretamente en la señalización negativa de esta ruta en el alga. Estudiar el papel de esta molécula señal en la asimilación de nitrógeno es importante para entender los mecanismos de regulación de la nutrición mineral y la eficiencia del proceso. El conocimiento a nivel molecular de los procesos de regulación de la asimilación de nitrógeno es un paso clave para el desarrollo de estrategias de cultivo que lleven a un alto rendimiento con un bajo aporte de fertilizantes nitrogenados. 2. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN A) Se ha estudiado el efecto del NO de la asimilación de nitrato y amonio. Se ha estudiado in vivo el efecto de diferentes donadores de óxido nítrico sobre las actividades de transporte de amonio, nitrato y nitrito, así como las enzimas nitrato reductasa, nitrito reductasa y glutamina sintetasa. También se ha estudiado el efecto de compuestos farmacológicos que permitieran identificar intermediarios de la señal de NO (inhibidores de proteínas quinasas, fosfodiesterasa, etc.). Finalmente se ha analizado un mutante de Chlamydomonas afectado en una guanilato ciclasa soluble regulada por NO (CYG56). La utilización de la nitrato reductasa recombinante nos ha permitido la realización de ensayos in vitro para estudiar el mecanismo de inhibición por NO. Mediante programas bioinformáticos se han analizado potenciales cisteínas nitrosilables en cada una de estas proteínas (transportadores o enzimas). B) Estudio de las hemoglobinas truncadas (THB1-4) de Chlamydomonas. Se han aislamiento los cDNAs de cuatro hemoglobinas truncadas, THB1-4. Dos de ellas se han expresado en E. coli y se han purificado las correspondientes proteínas. Las THBs purificadas se han analizado mediante dicroismo circular y se han estudiado para posibles funciones en el metabolismo del NO. Se han analizado los patrones de expresión génica en diferentes condiciones nutricionales de nitrógeno de las cuatro THB1-4. 3. CONCLUSIÓN En el presente trabajo se ha llegado a las siguientes conclusiones: 1. In vivo, el NO produce una inhibición rápida, eficiente y reversible del consumo de amonio, nitrato y nitrito. Esta inhibición se produce también sobre la actividad enzimática nitrato reductasa pero no sobre la nitrito reductasa ni la glutamina sintetasa. 2. La regulación de la expresión de THB1 y THB2 se ve afectada de forma diferente por la fuente de nitrógeno, por el factor de transcripción NIT2 y por NO. 3. Las proteínas THB1 y THB2 unen óxido nítrico. 4. La proteína THB1, por su homología con otras hemoglobinas truncadas de bacterias, por su inducción por NO y porque unen NO, se le considera una enzima con actividad dioxigenasa que participa en la retirada del NO intracelular. 4. BIBLIOGRAFÍA de Montaigu A, Sanz-Luque E, Galvan A, Fernandez E (2010) A soluble guanylate cyclase mediates negative signaling by ammonium on expression of nitrate reductase in Chlamydomonas. Plant Cell 22: 1532-1548 Fernández E, and Galván A. (2007) Inorganic nitrogen assimilation in Chlamydomonas. J. Exp. Bot. 58: 2279-2287. Fernández E, and Galván A. (2008) Nitrate assimilation in Chlamydomonas. Eukaryotic Cell, Apr 2008, 555-559. Gonzalez-Ballester D, de Montaigu A, Higuera JJ, Galvan A, Fernandez E. 2005. 22 Functional genomics of the regulation of the nitrate assimilation pathway in 23 Chlamydomonas. Plant Physiology 137: 522-533. Harris E (2009) The Chlamydomonas sourcebook. Second Edition. 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