Nuevas estrategias en la preparación de la muestra y en el desarrollo de plataformas para el análisis metabolómico orientado y global

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis La hipótesis que precedió al establecimiento de los objetivos sobre los que se planteó la investigación fue la existencia de un gran número de retos en metabolómica vegetal y animal de los que se requiere su abordaje. Por tanto el objetivo básico abarcó ambas áreas de la metabolómica: la vegetal y la animal. Los tres pilares en los que se soportó la investigación desarrollada fueron el diseño de la plataforma analítica apropiada para cada caso, la supervisión por investigadores con reconocida experiencia en metabolómica y la formación y capacidad de la doctoranda para aceptar y desarrollar los retos planteados. 2.contenido de la investigación La investigación realizada ha implicado: -Un estudio en profundidad de la bibliografía relacionada con el trabajo planteado, complementado con una actualización continua durante todo el desarrollo de la tesis para mantener la investigación en primera línea. Se prestó especial atención a temas relacionados con la preparación de la muestra y la metabolómica, incluyendo una herramienta comúnmente utilizada por el grupo de investigación al que pertenece la doctoranda: los ultrasonidos (US) usados como energía auxiliar para favorecer etapas analíticas. De hecho, la extracción asistida por US (USAE) [1], los US y la metabolómica [2] y el controvertido efecto de los US en la actividad enzimática [3] corresponden a tres publicaciones que constituyen la Sección A de la tesis. -La hidrólisis de la oleuropeína en extractos de hojas de olivo acelerada por diferentes hidrolasas y por la acción de los US (USAEH) [4] (que abre la puerta al complejo mundo del binomio enzimas–US), el uso de una plataforma basada en cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC–QTOF MS/MS) que proporcionó los datos para la identificación tentativa de 123 metabolitos de extractos que habían producido la inhibición de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis-C (HCV) [5]. Otro de los logros fue la exhaustiva identificación de los componentes de una planta controvertida, Cannabis sativa L., mediante plataformas basadas en cromatografía de gases–espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC–TOF/MS) y LC–QTOF MS/MS [6]. Ambas investigaciones, que constituyen la Sección B de la tesis, abren nuevas líneas de trabajo en metabolómica vegetal. -El exhaustivo estudio de una muestra apenas usada en clínica, el sudor, ha implicado: (1) el desarrollo de procedimientos para el muestreo y la preparación de la muestra; los primeros basados en estimulación de la sudoración mediante ejercicio moderado, con la forma convencional de estimulación química+eléctrica y una original por disolución de sudor seco utilizando soportes sólidos impregnados de los disolventes adecuados. (2) El análisis metabolómico de los dos primeros tipos de muestras y su comparación con sudor obtenido mediante el último tipo de muestreo [8,9]; todo lo cual forma parte de la Sección C. En todos los casos, el análisis no dirigido permitió establecer el tipo de muestreo dependiendo de los metabolitos de interés (compuestos polares, no polares o de polaridad media), que se sometieron a análisis no dirigido para su identificación tentativa en todos los tipos de sudor muestreado. La Sección C también recoge un estudio sobre muestreo de sudor después de ejercicio moderado, en el que se comparó su composición con la de sudor obtenido mediante muestreo pasivo utilizando diferentes procedimientos de inducción. Se ensayaron diferentes estrategias de derivatización para obtener situaciones instantáneas representativas del metaboloma del sudor, especialmente de los metabolitos no polares, como corresponde al uso de una plataforma GC–MS [8]. En los estudios de metabolómica clínica que se recogen en la Sección D se compararon diferentes estrategias de preparación de la muestra para la obtención del perfil de metabolitos en sudor con el uso de una plataforma GC–TOF/MS en modo de alta resolución [10]. La comparación mostró que una etapa de metoximación más sililación tras la desproteinización era la opción más adecuada para conocer la situación instantánea del metaboloma del sudor. También la Sección D recoge el estudio de muestras de sudor procedentes de dos cohortes de pacientes de cáncer de pulmón, analizadas mediante LC–QTOF MS/MS para configurar paneles de biomarcadores con los que discriminar estos pacientes de fumadores como individuos con factor de riesgo [11]. El uso de una herramienta como PanelomiX permitió reducir los falsos negativos (95% de especificidad) y los falsos positivos (95% de sensibilidad) y la proposición de dos paneles de biomarcadores: uno, con 96.9% de especificidad y 83.8% de sensibilidad, compuesto por el monoglicérido MG(22:2), los ácidos mucónico, subérico y urocánico y una tetrahexosa; el otro con 81.2% de especificidad y el 97.3% de sensibilidad, compuesto por el monoglicérido MG(22:2), los ácidos mucónico, nonanodioico y urocánico, y una tetrahexosa. La última de las investigaciones contenidas en la Sección C se refiere a aminoácidos existentes en sudor. Estos compuestos son metabolitos claves en la diagnosis y tratamiento de diversas enfermedades, como el cáncer, por lo que se determinan en diferentes biofluidos. La determinación cuantitativa de estos compuestos en sudor requirió la optimización de la preparación de la muestra que, dependiendo de la concentración, puede consistir en simple dilución o en microextracción centrífuga en fase sólida (c-SPµE) como etapa previa a la inserción en un cromatógrafo de líquidos conectado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo [7]. 3.conclusión La investigación realizada ha permitido extraer las siguientes conclusiones: -La extensa búsqueda bibliográfica [1–3], ha permitido una evaluación crítica del estado actual de los métodos basados en USAE para obtener componentes de plantas/alimentos y de los controvertidos efectos de los US en las enzimas y en su acción biocatalítica, pero también proporciona pautas para planificar investigación metabolómica de plantas, en la que la asistencia de los US es clave. -La investigación experimental contenida en esta Memoria de Tesis se orientó al análisis metabolómico, tanto dirigido como global, en las áreas vegetal y animal. La diversidad de los estudios desarrollados incluye el efecto de la preparación de la muestra en la cobertura conseguida en la detección y el efecto favorable de los US en las reacciones enzimáticas. La variedad de los estudios realizados también abarca el efecto del muestreo y la preparación de la muestra en la eficacia de la detección de componentes del sudor, así como el estudio de los cambios en los perfiles de los metabolitos en el sudor humano recogido después de estimulación mediante diferentes procedimientos. Las conclusiones más destacables de la investigación en metabolómica en el área vegetal son: • El método basado en USAEH para la obtención de la aglicona de la oleuropeína a partir de oleuropeína de extractos de hojas de olivo requiere menos de 20 min para la hidrólisis completa, lo que permite una comparación favorable con el método tradicional basado en incubación enzimática, que requiere 2 h [4]. • El fraccionamiento basado en extracción líquido–líquido secuencial con extractantes de diferente polaridad mejora drásticamente la cobertura de la identificación tentativa de metabolitos en los extractos enzimáticos acuosos del A. bisporus (123 metabolitos tentativamente identificados) [5]. • Se han identificado 169 compuestos (cannabinoides, terpenoides, lípidos, flavonoides, aminoácidos y ácidos orgánicos, entre los más destacables) en extractos polares y no polares, obtenidos con la asistencia de US, de 17 cultivos de Cannabis sativa L. Las plataformas GC–TOF/MS y LC–QTOF MS/MS maximizan la cobertura en la detección de componentes del cannabis, consiguiéndose identificar 46 compuestos en los extractos polares y 134 en los no polares [6]. En cuanto al efecto del muestreo y de la preparación de la muestra en la detección de metabolitos en sudor humano (Sección C), el uso de análisis dirigido y no dirigido permitió obtener las siguientes conclusiones: • El sudor es una muestra excelente para el análisis cuantitativo del perfil de aminoácidos en estudios clínicos, lo que resulta de interés teniendo en cuenta el papel biomarcador de estos compuestos. La dilución+c-SPµE ha demostrado ser decisiva para disminuir el efecto matriz del sudor humano y hacer así posible la cuantificación de aminoácidos mediante LC–MS/MS [7]. • El sudor activo, con respecto al sudor pasivo, está enriquecido en algunas familias de compuestos claves, tales como ácidos grasos, alcoholes, carbohidratos y aminoácidos no proteinogénicos. La LLE con diclorometano y posterior metoximación más sililación es la mejor opción entre los protocolos ensayados para obtener mediante GC–MS una instantánea representativa de los compuestos no polares del sudor activo [8]. • El muestreo de sudor seco es una alternativa para la estandarización de la recogida de sudor. El papel impregnado con etanol–PBS en proporción 1:1 (v/v) da lugar a los mejores resultados en términos de cobertura de la detección utilizando un análisis combinado mediante las plataformas GC–MS y LC–MS/MS. Se han detectado en sudor seco familias tales como carnitinas, esfingolípidos y N-acil-aminoácidos, que no aparecen o lo hacen a bajísima concentración en sudor fresco [9]. Los hallazgos más destacables en la mejora de la cobertura metabolómica del sudor para estudios clínicos han sido los siguientes: • La optimización de una nueva plataforma basada en GC–MS para el análisis de sudor revela la presencia de metabolitos que pueden ser de interés para el estudio de diferentes patologías. Es destacable la capacidad de la plataforma para detectar azúcares, lípidos y ácidos carboxílicos, familias cuya presencia había resultado insignificante cuando se utilizaron plataformas basadas en RMN o en LC–MS [10]. • El diseño de dos paneles de cinco metabolitos que incluyen aminoácidos, ácidos dicarboxílicos de cadena corta, azúcares y algunos lípidos permite discriminar pacientes con cáncer de pulmón del grupo de control con factor de riesgo. Este nuevo modelo de predicción es más robusto que el obtenido previamente por nuestro grupo, ya que se construyó con dos tandas de muestras recogidas y analizadas con una diferencia de tiempo de dos años y por diferentes analistas [11]. 4. bibliografía [1] M.M. Delgado-Povedano, M.D. Luque de Castro, Ultrasound-assisted extraction of food components, Chapter in: Reference Module in Food Science, 2017. [2] M.D. Luque de Castro, M.M. Delgado-Povedano, Ultrasound: A subexploited tool for sample preparation in metabolomics, Analytica Chimica Acta 806 (2014) 74–84. [3] M.M. Delgado-Povedano, M.D. Luque de Castro, A review on enzyme and ultrasound: A controversial but fruitful relationship, Analytica Chimica Acta 889 (2015) 1–21. [4] M.M. Delgado-Povedano, F. Priego-Capote, M.D. Luque de Castro, Selective ultrasound-enhanced enzymatic hydrolysis of oleuropein to its aglycon in olive (Olea europaea L.) leaf extracts, Food chemistry 220 (2017) 282–288. [5] M.M. Delgado-Povedano, V. Sánchez de Medina, J. Bautista, F. Priego-Capote, M.D. Luque de Castro, Tentative identification of the composition of Agaricus bisporus aqueous enzymatic extracts with antiviral activity against HCV: A study by liquid chromatography–tandem mass spectrometry in high resolution mode, Journal of Functional Foods 24 (2016) 403–419. [6] M.M. Delgado-Povedano, C. Sánchez-Carnerero Callado, F. Priego-Capote, C. Ferreiro-Vera, Untargeted characterization of extracts from Cannabis sativa L. cultivars by gas and liquid chromatography coupled to mass spectrometry in high resolution mode, Talanta, https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120384 [7] M.M. Delgado-Povedano, M. Calderón-Santiago, F. Priego-Capote, M.D. Luque de Castro, Study of sample preparation for quantitative analysis of amino acids in human sweat by liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Talanta 146 (2016) 310–317. [8] M.M. Delgado-Povedano, M. Calderón-Santiago, M.D. Luque de Castro, F. 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