Eficacia de plantas mutantes tilling de brassica rapa (braacax1.A) en la biofortificación con ca2+ y en la resistencia a distintos estreses abióticos

Resumen

La agricultura debe aumentar considerablemente su producción para poder alimentar a la creciente población mundial y con la dificultad añadida del actual escenario de cambio climático. Por otro lado, no solo es necesario proveer alimentos en cantidad suficiente, también es importante que estos alimentos sean seguros, nutritivos y de calidad. La biotecnología se postula coma una herramienta esencial para superar estos desafíos mediante el desarrollo de variedades más productivas, adaptadas a condiciones adversas, que requieran menor cantidad de insumos y que aumenten la acumulación de elementos minerales esenciales. El TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) es una técnica que ha demostrado ser útil en la mejora de los cultivos y que presenta la capacidad de identificar mutantes sin conocimiento previo del fenotipo y no requiere la obtención de transgénicos. Uno de los objetivos para la mejora vegetal podría ser la generación de variedades con una homeostasis más eficiente del calcio (Ca) debido a que este elemento es un macronutriente esencial y desempeña una función crucial en la señalización celular de las plantas. Este objetivo se podría alcanzar mediante la modificación de uno de los principales transportadores de Ca2+ de las plantas, los CAX (CAtion eXchangers). Estos transportadores son claves en la generación de distintos perfiles de Ca2+ citosólicos que sirven para responder a las señales ambientales o en los procesos de señalización celulares. Hay diversos transportadores CAX, pero CAX1 es el que posee una mayor actividad de antiporte H+/Ca2+ vacuolar. Diversos experimentos han conseguido mejorar la acumulación de Ca en plantas mediante la manipulación de este transportador. Debido a la importancia fisiológica del Ca y de CAX1, la modificación de este transportador puede afectar a los distintos procesos metabólicos de la planta entre los que destacan: la fotosíntesis, los procesos de estrés oxidativo, el metabolismo del nitrógeno (N), el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y la regulación fitohormonal. Asimismo, se ha postulado que la manipulación de los niveles de expresión de los transportadores CAX puede tener un efecto positivo en la productividad de la planta y/o la calidad nutricional de los alimentos. Por otro lado, ciertas modificaciones en estos transportadores pueden cambiar la especificidad de sustrato y por tanto las plantas resultantes pueden ser útiles para la fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados. Además, los transportadores CAX parecen jugar un papel esencial en las respuestas de las plantas ante un estrés. Así, la inducción de los transportadores CAX produciría un aumento en la concentración de Ca2+ en las plantas lo que reduciría el efecto negativo de estreses abióticos tales como la salinidad y la presencia de metales pesados. Dado el potencial para la mejora vegetal de modificaciones en CAX1, se ha usado la técnica TILLING para generar distintos mutantes con cambios aminoácidos en este transportador en una especie modelo en investigación como es Brassica rapa ssp. trilocularis 'R-o-18'. Para esta Tesis se han seleccionado tres de estos mutantes que poseen un único cambio aminoacídico distinto cada uno (BraA.cax1a-4, BraA.cax1a-7 y BraA.cax1a-12). La realización de la Tesis estuvo justificada por la necesidad de comprobar la efectividad del TILLING en la mejora vegetal en agricultura, para profundizar en el conocimiento existente sobre la función de CAX1 en las plantas y por la potencial aplicabilidad de los resultados obtenidos a cultivos próximos a B. rapa de gran interés agronómico. Así, el objetivo general de la presente tesis doctoral es el estudio de los tres mutantes BraA.cax1a centrado en la evaluación bioquímica y fisiológica con el fin de definir la función y papel del gen CAX1 en la mejora del cultivo de B. rapa. En concreto se analizó el efecto de dichas mutaciones en el transportador CAX1 de B. rapa en plantas cultivadas bajo tres condiciones: diferentes concentraciones de Ca en el medio de cultivo, toxicidad por cadmio (Cd) y estrés por salinidad. El primer objetivo de esta Tesis doctoral fue comprobar cómo se producía la acumulación de Ca2+ en las plantas mutantes crecidas a diferentes concentraciones de este catión en el medio de cultivo y evaluar la calidad nutricional y los efectos fisiológicos de cada mutación en CAX1 en la biofortificación con este elemento. Los resultados mostraron que los distintos mutantes BraA.cax1a presentaron diferente respuesta ante cambios en la disponibilidad de Ca en el medio en cuanto a su crecimiento, su fisiología y su acumulación de nutrientes. Las distintas mutaciones no causaron una mayor acumulación de Ca ante condiciones deficientes en el medio, pero si aumentaron su acumulación con un aporte óptimo y tóxico de este catión. Cabe destacar que la línea BraA.cax1a-12 acumuló más Ca que el parental R-o-18 en condiciones control, pero limitó su acumulación ante elevadas concentraciones evitando así su toxicidad. En cuanto a otros elementos minerales, los mutantes empleados en esta Tesis acumularon más Mg en las hojas cuando el Ca se aportó en una concentración adecuada y acumularon más Fe independientemente de la dosis de Ca. Con respecto a los efectos fisiológicos, se observó que las mutaciones BraA.cax1a afectaron claramente a la fisiología y al metabolismo de las plantas. Así, BraA.cax1a-4 y BraA.cax1a-7 mostraron síntomas de estrés como una menor cantidad de clorofila (Chl), una alteración del rendimiento de la fotosíntesis y mayores niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). La mutación BraA.cax1a-7 redujo la actividad de algunas enzimas del metabolismo del nitrógeno (N) y esta mutación junto con la mutación BraA.cax1a-4 aumentó la actividad de las enzimas de la fotorrespiración analizadas. Sin embargo, la mutación BraA.cax1a-12 no afectó negativamente al metabolismo de la planta y proporcionó una mejor tolerancia a las dosis altas de Ca. Esta tolerancia podría ser proporcionada por la mejora de las actividades de las enzimas del metabolismo del N, de las actividades fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y citrato sintasa (CS), y por una concentración más elevada de glutamato (Glu) y malato. La acumulación más alta de ácido indolacético (AIA) y la menor presencia del precursor de etileno también podría contribuir a la mayor tolerancia de BraA.cax1a-12. El segundo objetivo de esta Tesis Doctoral fue comprobar la tolerancia de cada mutante BraA.cax1a frente a la toxicidad por Cd y detectar procesos clave que determinen una mayor tolerancia a cada tipo de estrés. Con respecto a este objetivo se constató que la mutación BraA.cax1a-7 y especialmente la mutación BraA.cax1a-12 proporcionaron una acumulación más elevada de Cd en las hojas con respecto a R-o-18. Así, BraA.cax1a-12 registró la capacidad más alta de fitoextracción con más del triple del contenido de Cd de R-o-18. A pesar de ello, BraA.cax1a-12 presentó una mejor tolerancia a la toxicidad del Cd que podría deberse a una mejor homeostasis del Ca2+ en condiciones de estrés por este metal y a la mayor acumulación de Mg y Ca. Igualmente, dichas plantas presentaron una adecuada eficiencia fotosintética ante condiciones de toxicidad de Cd. Por otro lado, se observó que el genotipo BraA.cax1a-4 presentó una respuesta similar a la de las plantas R-o-18 aunque tuvo una capacidad más eficiente de detoxificación de H2O2 a través del ciclo ascorbato/glutation (AsA/GSH). Sin embargo, BraA.cax1a-12 presentó la más alta actividad del ciclo de AsA/GSH y una mejor capacidad de detoxificación de ROS. Además este genotipo presentó una actividad más elevada del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y una mayor acumulación de malato. Por otro lado, el genotipo BraA.cax1a-7 registró una respuesta negativa porque mostró menores concentraciones de AsA y ácidos orgánicos (OAs) y una actividad inferior del TCA. Además, los niveles más altos de giberelina 4 (GA4), y la menor presencia del precursor del etileno ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) en plantas BraA.cax1a-12 también podrían contribuir a su mayor tolerancia frente al Cd. El segundo tipo de estrés analizado en la presente Tesis Doctoral fue el estrés por salinidad. Los resultados mostraron que las distintas mutaciones BraA.cax1a afectaron a la respuesta frente a la salinidad. Así, la mutación BraA.cax1a-4 proporcionó una mejor tolerancia a la presencia de NaCl en el medio de cultivo. Esta tolerancia podría ser inducida por un mayor contenido de Ca y K en la parte aérea, una detoxificación más eficiente de ROS a través de las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), un mejor estado redox del AsA y una mayor actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Además, la mutación BraA.cax1a-4 proporcionó una mejora en el rendimiento fotosintético que se manifestó en unos valores más altos de eficiencia en el uso del agua (WUE), del ratio entre fluorescencia variable y fluorescencia máxima (Fv/Fm), de flujos de electrones y una mayor acumulación de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco). En contraste, la mutación BraA.cax1a-7 produjo algunos efectos negativos en el rendimiento de la fotosíntesis, como por ejemplo elevados valores emisión de fluorescencia y menores acumulaciones de Rubisco y carbohidratos solubles y una actividad G6PDH más baja. En cuanto al perfil fitohormonal, BraA.cax1a-4 mostró una concentración más alta de fitohormonas que podría estar relacionada con su mejor tolerancia a la salinidad. Concretamente, AIA y giberelinas (GAs) podrían promover el crecimiento en condiciones salinas y el ácido abscísico (ABA) podría dar lugar a una mejor respuesta frente al estrés y a una mayor eficiencia en el uso del agua. Como conclusión general, en esta tesis se describieron los cambios fisiológicos en B. rapa producidos por distintas mutaciones en el transportador CAX1 y su respuesta a distintos estreses. Se identificó a la mutación BraA.cax1a-12 como útil para la biofortificación de Ca, Mg, y Fe y para la fitorremediación de Cd y a la mutación BraA.cax1a-4 para proporcionar una mayor tolerancia a la salinidad. Además, se identificaron procesos metabólicos claves en la tolerancia a cada tipo de estrés estudiado.