Evolución y desarrollo del sistema apertural del polen en eudicotiledóneas basalesanálisis del gen inaperturate pollen1 e identificación de genes candidatos determinantes de la morfología apertural

Resumen

Las aperturas del grano de polen son áreas donde la pared se encuentra debilitada o ausente y juegan un papel principal en su supervivencia y éxito reproductivo. Una de las grandes incógnitas en el campo de la evolución y desarrollo es el determinismo genético de la enorme variedad de sistemas aperturales (forma, número y posición de las aperturas) existente en angiospermas (Furness and Rudall, 2004; Zhou and Dobritsa, 2019). En los últimos años ha habido avances importantes con el descubrimiento de las proteínas INAPERTURATE POLLEN 1 (INP1), indispensable para la formación de las aperturas en Arabidopsis thaliana, Zea mays y Oryza sativa (Dobritsa and Coerper, 2012; Li et al., 2018; Zhang et al., 2020); D6 PROTEIN KINASE LIKE 3 (D6PKL3) implicada en la formación y el determinismo del número de aperturas en Arabidopsis (Lee et al., 2018); y miembros de la familia ELMOD implicados en el determinismo del número de aperturas (ELMOD_A y B) y potencialmente en la forma de las aperturas (ELMOD_E) (Zhou et al., 2021). Sin embargo se desconoce si INP1, a pesar de la diversidad de su secuencia, conserva su función en otros grupos taxonómicos y apenas se conocen los procesos implicados en la formación de los diferentes sistemas aperturales. Estudios sobre el determinismo genético de las aperturas en la familia Papaveraceae, por su gran variedad de sistemas aperturales y por su posición filogenética, uno de los linajes más basales de Eudicotiledóneas (Wang et al., 2009), ayudarían a la comprensión de estas incógnitas. Esta tesis doctoral se desarrolla con el objetivo de estudiar la implicación de INP1 en la formación de aperturas en Eschscholzia californica, miembro de Papaveraceae. Por otro lado investigamos genes que posiblemente intervengan en la formación de las aperturas y en el determinismo de su forma. En el Capítulo 1 llevamos a cabo un estudio funcional de EcINP1 en Eschscholzia californica y proponemos genes candidatos a estar implicados en la formación de las aperturas. Analizamos la expresión temporal y espacial de EcINP1, validamos su función generando mutantes mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y comparamos la tasa de germinación y el transcriptoma de plantas salvajes con el de mutantes inp1. EcINP1 presenta su máxima expresión en anteras en estadio de desarrollo del polen de tétradas y su papel como un factor esencial para la formación de las aperturas es conservado. En Eschscholzia californica las aperturas son prescindibles para la germinación del polen. Además, encontramos 971 genes diferencialmente expresados (DEGs) entre plantas salvajes y EcINP1-mutantes, entre los que destacamos los que son potenciales candidatos a intervenir en el proceso de formación de las aperturas, como los homólogos en E. californica de NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN 1 (NAP1), D6 PROTEIN KINASE LIKE 3 (D6PKL3) y PROTEIN KINASE ASSOCIATED WITH BRX (PAX). Estos genes mostraron patrones de expresión coincidentes con los de EcINP1, que apoyan su implicación en la formación de las aperturas y/o posible interacción de sus productos con la proteína EcINP1. En el Capítulo 2 identificamos genes que podrían estar implicados en el determinismo de la forma de las aperturas. Secuenciamos el transcriptoma de cuatro especies de Papaveraceae, de las que tres no está disponible su genoma de referencia, por lo que generamos un ensamblaje de referencia de novo para cada una de ellas. Filtramos y anotamos los ensamblajes de novo generados. Comparamos el transcriptoma de dos especies con polen colpado con el de otras dos con polen porado y analizamos los DEGs entre ambos grupos. Encontramos 531 DEGs entre los cuales no se encontraba el gen ELMOD_E, el único descrito hasta el momento como un posible factor determinante para la forma de las aperturas (Zhou et al., 2021), por tanto parece que ELMOD_E no regula el cambio de colpo a poro en Papaveraceae. En cambio INP1 si se encontraba diferencialmente expresado. Por otro lado, entre los DEGs encontramos genes implicados en procesos que posiblemente intervienen en la formación de las aperturas, como los relacionados con la síntesis o degradación de la calosa, destacando el factor de transcripción DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1 (DYT1) o con la organización de elementos del citoesqueleto. Referencias Dobritsa AA, Coerper D. 2012. The novel plant protein INAPERTURATE POLLEN1 marks distinct cellular domains and controls formation of apertures in the Arabidopsis pollen exine. The Plant Cell 24: 4452-4464. Furness CA, Rudall PJ. 2004. Pollen aperture evolution–a crucial factor for eudicot success?. Trends in plant science 9: 154-158. Lee BH, Weber ZT, Zourelidou M, et al. 2018. Arabidopsis protein kinase D6PKL3 is involved in the formation of distinct plasma membrane aperture domains on the pollen surface. The Plant Cell 30: 2038-2056. Li P, Ben-Menni Schuler S, Reeder SH, Wang R, Suárez Santiago VN, Dobritsa AA. 2018. INP1 involvement in pollen aperture formation is evolutionarily conserved and may require species-specific partners. Journal of Experimental Botany 69: 983-996. Wang W, Lu AM, Ren Y, Endress ME, Chen ZD. 2009. Phylogeny and classification of Ranunculales: evidence from four molecular loci and morphological data. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics 11: 81-110. Zhang X, Zhao G, Tan Q. 2020. Rice pollen aperture formation is regulated by the interplay between OsINP1 and OsDAF1. Nature Plants 6: 394-403. Zhou Y, Dobritsa AA. 2019. Formation of aperture sites on the pollen surface as a model for development of distinct cellular domains. Plant Science 288: 110222. Zhou Y, Amom P, Reeder SH, Lee BH, Helton A, Dobritsa AA. 2021. Members of the ELMOD protein family specify formation of distinct aperture domains on the Arabidopsis pollen surface. Elife 10: e71061.