Generación y evaluación in vivo de modelos bio-artificiales de nervio periférico descelularizado de estructura y visco-elasticidad controladas

Résumé

La Ingeniería Tisular tiene por objetivo generar tejidos artificiales, cada vez más biomiméticos y biocompatibles, que le permitan reparar, restaurar o incluso mejorar las funciones de tejidos y órganos dañados. Para ello la ingeniería tisular está enfocada actualmente en la búsqueda y desarrollo de nuevos biomateriales y técnicas de biofabricación que los guie a tales fines. Sin embargo, a pesar del gran avance conseguido en este campo, los métodos de biofabricación actuales no consiguen alcanzar el grado de complejidad histológica, composición tisular y molecular de algunos órganos, como es el caso del nervio periférico. En este sentido, la técnica de descelularización tisular ha surgido como una alternativa prometedora en este campo. Este método permite la generación de substitutos y/o matrices acelulares que conservan la disposición estructural y composición molecular de la mayoría de componentes de la matriz extracelular, obteniendo un biomaterial natural altamente biomimético que provee un microambiente pro-regenerativo para la regeneración de tejidos humanos como el nervio o la piel. En este contexto, los aloinjertos nerviosos acelulares representan una alternativa prometedora a la reparación de lesiones nerviosas estructurales, ya que tienen una aceptable capacidad para promover la regeneración tisular y recuperación funcional. Sin embargo, todo proceso de descelularización puede conllevar una alteración de las características de dicha matriz extracelular, pudiendo llegar a comprometer las propiedades estructurales, biomecánicas y/o biológica de los mismos. Por lo tanto, es necesario generar nuevos protocolos de descelularización tisular orientados a una eficiente eliminación del componente celular, una adecuada preservación de la matriz extracelular y nuevas estrategias para preservar o incrementar sus propiedades biomecánicas. A este respecto, en la presente Tesis Doctoral se han abordado dos principales estrategias para la generación de nuevos sustitutos de nervio periférico mediante ingeniería tisular, que podrían ser también aplicados a otros tejidos como la piel humana. En primer lugar, se evaluó el impacto del entrecruzamiento químico con el agente natural genipín en sustitutos de nervio descelularizados previamente descritos (métodos de Sondell y Roosens). El objetivo de esta primera estrategia fue generar matrices neurales con propiedades mecánicas mejoradas. El impacto de dos concentraciones de genipín (0.10 y 0.25%) en las matrices neurales descelularizadas fue evaluado a nivel histológico, biomecánico y biológico. En segundo lugar, se desarrollaron tres nuevos métodos de descelularización química con el objetivo de lograr un grado eficiente de eliminación del componente celular y una adecuada preservación de la estructura y composición de la matriz extracelular neural. Estos nuevos aloinjertos neurales descelularizados fueron sometidos a una completa caracterización ex vivo y posteriormente se evaluó su eficacia terapéutica in vivo. En el primer estudio, la histología confirmó las diferencias entre los métodos de Sondell y Roosens, y que el entrecruzamiento con genipín no indujo cambios histológicos evidentes, corroborando una adecuada preservación de la histología del nervio. La prueba biomecánica de tracción reveló que genipín mejoró las propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos descelularizados de Sondell y Roosens, siendo estos últimos los más comparables al comportamiento biomecánico de los nervios nativos utilizados como control. La evaluación de la biocompatibilidad de los aloinjertos nerviosos descelularizados realizada con células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo, y cultivadas sobre las matrices generadas, confirmó un alto grado de biocompatibilidad en todos los grupos. Los resultados fueron especialmente positivos en el grupo Roosens tratados con 0,10% de genipín. Finalmente, este estudio demostró que el uso de genipín podría ser una alternativa eficiente para mejorar las propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos descelularizados con un ligero impacto en la biocompatibilidad y el patrón histológico. Por estas razones, planteamos la hipótesis de que nuestros nuevos aloinjertos nerviosos descelularizados reticulados podrían ser una alternativa adecuada para futuros estudios preclínicos in vivo. En segundo lugar, se llevó a cabo una completa caracterización (histológica, ultraestructural, bioquímica, biomecánica y de biocompatibilidad) de los tres nuevos aloinjertos descelularizados de nervio periférico. En estos tres nuevos métodos químicos-enzimáticos se utilizaron diferentes concentraciones de detergentes (Tritón X-100, dodecil sulfato de sodio, desoxicolato de sodio) y enzimas (ARNasa y ADNasa) o, en su defecto, una solución de ácido perácetico, y se compararon con la eficacia del método de Sondell. El análisis histológico demostró una eliminación de material celular y mielina eficiente. El análisis de la matriz extracelular confirmo un alto grado de preservación de las fibras de la matriz, así como de la glicoproteína laminina, especialmente en los protocolos 1 y 2. Por último, no se observaron cambios significativos a nivel biomecánico, y las todas las matrices mostraron un alto grado de biocompatibilidad ex vivo. En función de los resultados ex vivo, se seleccionaron los protocolos 1 y 2, cuya eficacia regenerativa fue evaluada a las 15 semanas tras la reparación de defectos de 10-mm de longitud en el nervio ciático de ratas. Se utilizaron como controles, el método gold standard y sustitutos descelularizados obtenidos mediante la técnica de Sondell. El análisis clínico y funcional confirmó un grado de recuperación motora y sensitiva parcial y comparable al autoinjerto nervioso. La evaluación histológica, immunohistoquímica, ultraestructural y morfométrica confirmó la regeneración del tejido nervioso a lo largo de los injertos implantados, siendo, siendo el Protocolo 2 el protocolo el más eficaz, ya que los resultados fueron comparables al grupo autoinjerto, pero sin lograr superarlo. Finalmente, los resultados obtenidos en esta Tesis doctoral avalan por un lado, la utilización de genipín para generar sustitutos nerviosos descelularizados biocompatibles con propiedades biomecánicas mejoradas. Por otro lado, ha sido posible desarrollar un nuevo método de descelularización neural altamente eficiente, cuyos resultados in vivo fueron comparables al autoinjerto nervioso. Estos resultados sugieren que estos nuevos aloinjertos descelularizados podrían ser una terapéutica en la reparación quirúrgica de lesiones de nervios periféricos y podrían tener utilidad en la regeneración de otras estructuras como la piel humana.