Proteínas quimera de los dominios SH3 de la c-Src y Abl tirosina quinasaun estudio de las bases moleculares del entrecruzamiento tridimensional de dominios

Resumen

El principal objetivo de esta Tesis doctoral es el estudio de procesos de plegamiento alternativo que sufren algunas proteínas. Entre estos se encuentran el entrecruzamiento de dominios y la formación de fibras amiloides. En esta Tesis nos hemos centrado en una proteína modelo para poder desarrollar estos estudios como es el dominio SH3 de la c-Src tirosina quinasa. Nuestros estudios se han centrado principalmente en el papel del llamado lazo bisagra en la apertura de los dominios para formar los oligómeros entrecruzados. Se han intercambiado dos de los lazos del dominio SH3 que, además de realizar un papel clave en la función del dominio, son susceptibles de sufrir la apertura. De esta forma, se han construido proteínas quimeras del dominio c-Src-SH3 y Abl-SH3 en los que se han intercambiado los lazos RT y n-Src de forma independiente o simultánea. Se ha seleccionado el dominio SH3 de la Abl porque en este ni se ha descrito la formación de fibras amiloides ni la de oligómeros entrecruzados y, además, presenta una composición de los lazos con cambios en residuos importantes para la estabilización el dímero entrecruzado del domino c-Src SH3. También se ha estudiado el efecto de las mutaciones oncogénicas del dominio SH3 de la variante viral de la c-Src tirosina quinasa, la v-Src, que aparecen precisamente en los lazos intercambiados. Se ha llevado a cabo un estudio estructural y la caracterización biofísica de todas las proteínas objeto de estudio. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que, al menos en el caso del dominio c-Src SH3, existen otros factores que facilitan la formación de dímeros entrecruzados, más allá de la composición del lazo. En efecto, la sustitución de los lazos RT y n-Src del dominio Abl da lugar a un dímero entrecruzado en el cual los dos lazos actúan como lazo bisagra. En todas las condiciones estudiadas no se ha logrado la formación de dímeros entrecruzados de las quimeras Abl con los lazos del dominio c-Src. La caracterización biofísica demuestra que mientras la sustitución de los lazos de la Abl en el domino c-Src apenas producen cambios en la estabilidad del dominio, el efecto es mucho más notable en las quimeras del domino Abl en la que se han introducido los lazos del dominio c-Src-SH3. En cuanto a la formación de fibras amiloides, hemos corroborado la presencia de estos en aquellos dominios que se han obtenido como dímeros entrecruzados. Son de especial interés los resultados obtenidos con la variante oncogénica del dominio c-Src SH3. La formación del dímero entrecruzado solo se ha obtenido en la proteína que contiene las mutaciones en el lazo n-Src, pero no en el lazo RT. Se han obtenido las estructuras de tres variantes de este dominio que permiten analizar la pérdida de estabilidad de este dominio mientras conserva la capacidad de unir secuencias ricas en prolina. En este dominio la mutación de Arg95Trp conduce a la pérdida de un puente salino que es clave para estabilizar el dímero entrecruzado. Además, la presencia del Trp95 en el lazo hace la proteína más inestable y susceptible de agregarse formando fibras amiloides.