Separación y caracterización de glicopéptidos y glicanos en fluidos biológicos. Aplicación al diagnóstico del cáncer y otras patologías

Resumen

La presente tesis doctoral se centra en el desarrollo de nuevos métodos de análisis para la identificación y separación de glicopéptidos y glicanos utilizando técnicas microseparativas acopladas a la espectrometría de masas (cromatografía de líquidos capilar y electroforesis capilar, CapLC-MS y CE-MS). Aunque el análisis de los glicopéptidos es una estrategia habitualmente utilizada para la caracterización de productor farmacéuticos, continua siendo difícil la detección de glicoformas poco abundantes que podrían ser esenciales para diferenciar proteínas endógenas de variantes recombinantes. De este modo, en esta tesis se han desarrollado dos métodos para la purificación selectiva de glicopéptidos, obtenidos de digestos de glicopeotínas, utilizando la eritropoetina humana recombinante (rhEPO) como glicoproteína modelo. Por otro lado, en muchas patologías se han descrito alteraciones en los glicanos de ciertas glicoproteínas en presencia de procesos inflamatorios importantes y muchos tipos de cáncer. Además, dado que ciertas estructuras de glicano así como tipos de enlace han estado relacionados con enfermedades específicas, la caracterización exhaustiva de los tipos de enlace de los isómeros de los glicanos ha suscitado gran interés biomédico en los últimos años. En este sentido, se han establecido en esta tesis doctoral diferentes metodologías para la caracterización de los isómeros de los glicanos de la alfa-1-glicoproteína ácida (hAGP), la cual ha generado interés biomédico dada la alteración de sus glicanos en ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Primero, la digestión con diversas exoglicosidasas (sialidasa, fucosidasa y galactosidasa) en combinación con el análisis de los glicanos per cromatografía de líquidos capilar de interacción hidrofílica zwitteriònica acoplada a la espectrometría de masas (CapZICHILIC- MS) y la estrategia GRIL utilitzando [12C6]/[13C6]-anilina, permitió asignar los enlaces de los ácidos siálicos, así como de las fucosas de los isómeros de los glicanos de la hAGP. Por otro lado, se desarrolló un método para asignar los isómeros de los glicanos per espectrometría de masas en tándem de alta resolución. La posibilidad de separar los isómeros antes de la detección, juntament con la obtención de la masa exacta de los iones fragmentos, permitió el establecimiento de un método de caracterización de los glicanos fiable por CapZIC-HILIC-MS/MS. Además, la doctoranda realizó una estancia en la Freie Universität Berlin (Berlin, Alemania), bajo la supervisión del Dr. Kevin Pagel, para estudiar la separación de los isómers de glicanos per espectrometría de movilidad iónica acoplada a la espectrometría de masas (IMMS). Finalmente, el método por CapZIC-HILIC-MS en combinación con la estrategia GRIL utilitzando [12C6]/[13C6]-anilina se aplicó en esta tesis para el análisis de muestras patológicas, con el fin de evaluar posibles alteraciones en los isómeros de los glicanos de dos glicoproteínas de fase aguda, l’hAGP y la transferrina de ratón (mTf), en presencia de ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Además, se emplearon herramientas quimiométricas con el objetivo de identificar glicanos como candidatos biomarcadores de estas patologías.