Anaerobic microbial transformation of chlorinated alkanes in cultures derived from Besòs River estuary sediments /

Resumen

RESUMEN Los compuestos orgánicos halogenados (organohalogenados) son recalcitrantes y presentan efectos tóxicos para la salud humana y el ecosistema. Entre los organohalogenados, los alcanos clorados como los cloroetanos y cloropropanos reciben menor atención a pesar de su amplio uso en la industria y su impacto ambiental. Los procesos fisicoquímicos son la tecnología más ampliamente utilizada para el tratamiento de aguas subterráneas contaminadas con estos compuestos aunque estas técnicas tienen un alto coste operacional y requieren una etapa de post-tratamiento para destruir completamente estos compuestos. En este contexto, la biodegradación se considera más adecuada por su mejor relación coste-eficiencia y a que son tecnologías más respetuosas con el medio ambiente. En este estudio se quiere obtener un cultivo enriquecido en bacterias dehalorespiradoras capaces de transformar alcanos halogenados. A partir de unos sedimentos de la desembocadura del rio Besòs (Barcelona, Espanya) se estableció un cultivo anaerobio estable y no metanogénico que exclusivamente dehalogenaba cloro- y bromoalcanos que tienen los átomos de halógenos en carbonos adyacentes vía dihaloeliminación. La aplicación de cebadores específicos derivados a partir del gen 16rRNA de diferentes bacterias dehalorespiradoras junto con las observaciones fisiológicas del cultivo declorador indicaron que una cepa de Dehalogenimonas era la responsable de la degradación de los alcanos clorados. El aumento de copias del gen 16S rRNA de Dehalogenimonas determinadas por qPCR demostraron que la decloración de 1,2-dicloropropano (1,2-DCP) se producía en paralelo al crecimiento de Dehalogenimonas. Durante la biodegradación anaerobia de 1,2-DCP y 1,2-dicloroetano (1,2-DCA) por el cultivo enriquecido con Dehalogenimonas se determino el fraccionamiento isotópico del C así como para la pareja C-Cl, respectivamente. El análisis del isótopo de carbono durante la degradación de 1,2-DCP por Dehalogenimonas presenta un fraccionament isotópico (ε_bulk^c) de -15.0 ± 0.7 ‰ que es significativamente diferente al de otras cepas de Dehalococcoides aunque tienen la misma dehalogenasa reductiva funcional (DcpA) implicada en la degradación de 1,2-DCP a propeno. La correlación del fraccionamiento isotópico obtenido para la pareja C-Cl (Ʌ = 1.89 ± 0.02) durante la dicloroeliminación de 1,2-DCA por Dehalogenimonas era significativamente diferente tanto de los obtenidos previamente para Dehalococcoides catalizando una reacción similar de dehaloeliminación, como de los de la oxidación aerobia de 1,2-DCA. Estos resultados sirven para ilustrar la potencialidad del uso del fraccionamiento isotópico simultáneo del C-Cl para distinguir entre diferentes mecanismos de reacción (oxidación, dehalogenación hidrolítica y dehaloeliminación) Después de alcanzar el reto de obtener un cultivo estable, el aislamiento de Dehalogenimonas fue el siguiente objetivo. Hasta hoy, solo 3 especies del género Dehalogenimonas han estado aisladas y ésta es la primera que se cultiva en Europa. Para abordar el aislamiento se ha hecho servir el método de dilución hasta la extinción y la adición de antibióticos selectivos. Después de 13 transferencias secuenciales de este cultivo de partida alimentado con 1,2-DCP y dos diluciones consecutivas 1:107 seguidas por la adición de estreptomicina durante 5 transferencias, se hizo una genoteca que demostró que el cultivo estaba formado predominantemente por Dehalogenimonas sp. (87%), pero también había Desulfovibrio sp. (12%) y una Vellonellaceac no clasificada (1%). Actualmente se está continuando el trabajo en nuestro laboratorio para conseguir el aislamiento de Dehalogenimonas sp. En este estudio se ha intentado hacer una lista preliminar de dehalogenasas reductivas (RDase) candidatas a estar involucradas en la transformación del 1,1,2.tricloroetano (1,1,2-TCA) y 1,2-dibromoetano (EDB) en Dehalogenimonas utilizando la técnica de shotgun proteomics (LTQ-Orbitrap). Además, se utilizaron electroforesis con gel de poliacrilamida azul nativo (BN-PAGE) combinado con ensayos de actividad decloradora para identificar la RDase responsable de la dicloroeliminación del 1,1,2-TCA. Aunque se detectó actividad decloradora en una banda del gel, no se identificó la RDase ni por cromatografía líquida acoplada con un espectrómetro de masas (LC-MS/MS) ni por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. La ausencia de RDAse pudo ser debida a varias razones, entre ellas la baja concentración de proteína y el uso de una base de datos que se construyó a partir de anotaciones de los genomas de otras Dehalogenimonas, porqué nuestra cepa aun no está secuenciada. Finalmente, se construyó un co-cultivo sintrófico de Dehalogenimonas y Dehalococcoides mccartyi para alcanzar la completa detoxificación de 1,1,2-TCA hasta eteno. En este co-cultivo, Dehalogenimonas transforma 1,1,2-TCA via dihaloeliminación a cloruro de vinilo, mientras que Dehalococcoides reduce el cloruro de vinilo vía hidrogenolisis a eteno. Se ha hecho un cambio de escala a un reactor anaerobio de 5 L operando en semicontinuo. En este estudio se ha demostrado, a partir de una combinación sintética de bacterias, la capacidad de detoxificar 1,1,2-TCA cuando estos microorganismos presentan capacidades metabólicas complementarias.