Obtención de un fragmento de anticuerpo específico contra oligómeros de A? como agente inmunoterapéutico de la enfermedad de Alzheimerdemostración de su eficacia en el modelo murino 3xTg-AD y mejora de su estabilidad termodinámica

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (AD) se ha convertido en un problema de primer orden en países desarrollados debido al coste sanitario social y humano que conlleva. La hipótesis de la cascada amiloide, la más aceptada por la comunidad científica, sitúa al péptido A? como el responsable directo del proceso neuropatológico, concretamente a los oligómeros de A?. En la actualidad, existen multiples tratamientos sintomáticos-paliativos, sin que ningúno se haya descrito como curativo. Recientemente, la inmunoterapia ?-amiloide se ha revelado como una posible herramienta en el tratamiento de la AD. En contraste con los anticuerpos completos, la administración de los scFv (fragmentos variables de cadena sencilla) no produce ni meningoencefalitis ni hemorragia cerebral. El uso de moléculas tipo scFv ha conseguido resultados prometedores en estudios pre-clinicos. Se trata de proteinas quimericas en donde se han fusionado los dominios VH y VL mediante un conector flexible, manteniendo la especificidad antígenica.En la presente tesis, se abordó la expresión recombinante de scFv-h3D6, un derivado de un anticuerpo monoclonal específico para los oligómeros de A? (mAb-h3D6, o bapineuzumab), en un sistema bateriano (E. coli) deficiente en reductasas y en co-expresión con los carriers Trx y NusA; asi como, su purificación mediante técnicas cromatográficas. La proteína presenta un plegamiento típico de las inmunoglobulinas. Su caracterización biofísica, permitió observar que bajo tratamiento térmico la molecula muestra tendencia a la agregación, promovida por la presencia de un estado intermediario con un componente-? worm-like enriquecido. De igual forma se evidenció durante el proceso de desplegamiento inducido por urea, la acumulación de un estado intermediario metaestable compuesto por el dominio menos estable (VL) desplegado y el dominio VH plegado; sugiriendo al dominio VL como el blanco para el rediseño de la estabilidad termodinámica global de la molécula. Auxiliándose en un modelo de la estructura tridimensional, se crearon una serie de variantes proteicas con el fin de aumentar la estabilidad del dominio VL. Dicho modelo tridimensional también reveló que el dominio VL, localizado en el C-terminal de la molécula, terminaba antes de que la última cadena-? fuera completada, por lo que decidimos extender dicho extremo en base a un alineamiento de 24 secuencias de scFvs depositados en el PDB.De ellos, las tres variantes de elongación del C-terminal presentaron un incremento en la estabilidad termodinámica de hasta el 26% y una disminución en la tendencia a la agregación de unos 4ºC. Esta mejora es deseable en una molécula de interés terapéutico, ya que ha de permitir una mayor vida media in vivo.Por otro lado, se examinó el efecto in vivo del scFv-h3D6 wild-type en un modelo murino triple transgénico que desarrolla la enfermedad de Alzheimer (3xTg-AD). El tratamiento se aplicó en una única dosis intraperitoneal en ratones hembra de 5 meses de edad, correspondiente a los primeros estadios de la enfermedad. Los beneficios del potencial terapéutico del scFv-h3D6 se mostraron a los 5 días, tanto a nivel conductual, como celular y molecular; principalmente, por su capacidad de eliminar los oligómeros de A? del córtex y el bulbo olfatorio, así como de restaurar los niveles de las apolipoproteínas apoE y apoJ (clusterina) en córtex y en hipocampo. En resumen, la presente tesis hace un recorrido desde la obtención inicial y mejora de un fragmento de anticuerpo hasta la demostración de su eficiencia en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer.