Characterization of new strategies to overcome the barrier of neutralizing antibodies in the aav-based gene therapy

Resumen

La terapia génica se basa en la administración de un gen terapéutico (transgen) al interior de las células para lograr acción correctora. El uso de vectores que porten el transgén mejorará la capacidad de lograr alcanzar la célula diana. Estos vectores, pueden ser no-virales o virales como los basados en adenovirus, virus adenoasociados (AAV) siendo los derivados AAV el foco de esta tesis doctoral. AAV pertenece a la familia Parvoviridae, tiene un genoma DNA de cadena simple de 4.7Kb caracterizada que contiene dos genes (Rep y Cap) flanqueados en los extremos una secuencia invertida repetida terminal (ITR) que forman una estructura en forma de horquilla y que juegan un papel esencial en la replicación y encapsidación del genoma viral. Los vectores basados en AAV (rAAV) se generan al eliminar los genes Rep y Cap y sustituirlos por el casete de expresión habitualmente formado por un promotor el transgen y la señal de poliadenilación. La exposición a AAV, tanto wtAAV como tras la administración de rAAV generará anticuerpos neutralizantes (NABs). Los NABs son muy eficaces a la hora de neutralizar la infección y eliminar el rAAV. Por lo que la presencia de NABs frente a un serotipo en el organismo, prevendrá la administración eficaz de ese serotipo y en muchos casos muestran reacción cruzada con otros serotipos impidiendo la administración de estos. Actualmente se han descrito diferentes estrategias para evitar la acción de los NABs y poder administrar rAAV pudiendo encuadrarlas en estrategias enfocadas en actuar sobre el vector o en actuar sobre el paciente. En esta tesis doctoral se han aplicado con éxito las estrategias de emplear diferentes serotipos en administración secuencial y el empleo de la immunoadsorción (IAD) como técnica de aféresis para eliminar los NABs circulantes frente al vector que deseamos administrar. La administración secuencial de los vectores AAV5 y AAV1 no mostró efectos tóxicos en los animales. Tras la administración del vector AAV5 se observó presencia del primer transgén en plasma y se desarrolló inmunidad humoral específica frente a la cápside (Anti-AAV5 NABs). Tras la segunda administración (AAV1), los animales inmunizados frente a AAV5 mostraron similar nivel de expresión del segundo transgén. Por lo que se puede concluir que la presencia de anti-AAV5 NABs, no cros-reacciona con el serotipo AAV1. El segundo objetivo de la tesis fue eliminar el efecto negativo de los NABs circulantes mediante el empleo de la técnica de IAD. Previo al objetivo de eliminar los NABs circulantes, tuvimos que adaptar la técnica de IAD a animales de pequeño tamaño y demostramos que la IAD disminuía 10 veces la concentración de anticuerpos circulantes en los animales. Tras esto, decidimos emplear la IAD para eliminar los anti-AAV5 NABs de animales previamente inmunizados, como paso previo a re-administrar AAV5. La re-administración de los animales que había sido sometidos a IAD mostraron una presencia del transgén en plasma muy superior a los animales que no habían recibido el tratamiento de IAD. Por lo que pudimos concluir que la eliminación de los anti-AAV5 NABs circulantes mediante IAD permitía la expresión del vector AAV5 en animales inmunizados.