Structural Determiants Of Adenophostin a Activity. Proposal and Synthetic Approach to new Adenophostin a Analogues

Resumen

1D-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3) és un segon missatger que té un paper molt important en l'activitat dels magatzems de calci intracel·lulars així com en l'entrada de calci al citoplasma.Estímuls extracel·lulars tals com hormones, neurotransmissors or factors de creixement (primers missatgers) són capaços d'unir-se a receptors específics localitzats a la part exterior de la membrana cel·lular. Com a resultat d'aquesta unió té lloc l'activació de la fosfolipasa C localitzada a la membrana cel·lular. Aquesta, al seu torn, catalitza la hidrólisi de fosfolípids, alliberant-se diacilglicerol (DAG) i IP3 (segon missatger).L'any 1993, Takahashi i col·laboradors aïllaren d'un cultiu de Penicillium brevicompactum, dos potents gliconucleòtids trisfosfat: Adenofostina A i B. Aquests compostos són els agonistes més potents descrits fins ara, presentant activitats de 10 a 100 vegades superiors a les del propi IP3.Des d'un punt de vista químic, les adenofostines comparteixen amb l'IP3 l'agrupació bisfosfat trans-diequatorial flanquejada per un grup hidroxil a la posició C-2'' (veure figura). A més a més, les adenofostines són resistents als enzims que metabolitzen l'IP3 com per exemple IP3-fosfatasa i IP3-quinasa. S'han sintetizat molts anàlegs de les adenofostines amb la finalitat per una banda d'elucidar les característiques estructurals responsables de la seva activitat i per l'altra d'obtenir compostos més actius. Tantmateix, fins a dia d'avui, solament pocs anàlegs han superat l'activitat de l'IP3 i cap d'ells ha conseguit superar l'activitat de les adenofostines.Estudis d'estructura-activitat han permés dissenyar un model farmacófor per a l'adenofostina A. Les principals característiques del qual són:La unitat bisfosfat trans-diequatorial flanquejada pel grup 2''-OH, el qual és un punt clau en la'activitat de l'adenofostina i mimetitzaria la unitat 4,5-bisfosfat-6-OH de l' IP3.La presència de l'adenina (o qualsevol estructura equivalent) incrementa l'activitat respecte a la de l' IP3. En aquesta direcció, s'han proposat dos possibles papers per a l'adenina. Per una banda, l'adenina podria permetre un millor posicionament de 2'-fosfat mitjançant una conformació C2'-endo (paper indirecte). Per l'altra, l'adenina podria estar implicada directament en interaccions complementàries amb una regió localitzada prop del centre d'unió (paper directe) permetent d'aquesta manera evitar l'efecte del domini inibidor C-terminal. Concretament, s'ha proposat l'existència d'una interacció catió-entre l'adenina i un residu d'argininia (Arg 504).Un estudi recent dut a terme en col·laboració amb el Dr. Morère, ha mostrat que els receptors de la manosa-6-fosfat són capaços de reconéixer anàlegs de manosa que incorporen grups carboxilats isòsters. En concret, s'ha mostrat que els anàlegs carboxilats tenen la mateixa afinitat per receptor que la manosa-6-fosfat. A més a més, amb aquesta substitució (fosfat-carboxilat) és pot evitar la labilitat dels grups fosfat.Com s'ha mencionat anteriorment, les adenofostines són resistents als enzimes que metabolitzen l' IP3. En aquest sentit, és ben conegut que la presència d'un àtom de flúor a la posició 2' en un glicòsid incrementa l'estabilitat de l'enllaç glicosídic especialment davant la hidròlisi àcida.Amb aquests antecedents, es va proposar estudiar la capacitat del IP3R per reconéixer efetivament anàlegs d'adenofostina en els quals un o més grups fosfats han estat reemplaçats per unitats metilencarboxilat. D'altra banda, també es va proposar incrementar l'estabilitat de l'adenofostina mitjançant la introducció d'un àtom de fluor a la posició C-2''.D'aquesta manera, el present treball s'ha centrat en dos punts principals:El primer és confirmar les interaccions de l'adenina amb el receptor i el paper del fosfat 2' en l'activitat de l'adenofostina. En aquest sentit, s'ha dut a terme l'evaluació biològica de: IP3, adenofostina A, inositol 4,5-bisfosfate (IP2), and 2'-defosfo-adenophostina A. Els primers assaigs es van dur a terme utilitzant el receptor en la seva forma completa, el fragment corresponent al domini d'unió i aquest mateix fragment incorporant una mutació a la posició 568 (Arg a Gln). Aquest residu interacciona amb el fosfat 1 de l'IP3 i es creu que interaccionaria també amb el fosfat 2' de l'adenofostina. Els següents assajos es van realitzar utilitzant el mateix fragment anteriorment citat, però aquest cop incorporant una mutació a la posició 504 (Arg a Gln). Es creu que aquest residu podria formar una interacció tipus catió- "stacking" amb l'adenina. Del resultat d'aquestes evaluacions biològiques, es pot deduir que l'activitat de l'adenofostina es deguda principalment a la presència de l'adenina i, a més a més, la suposada òptima disposició del fosfat 2' no es determinant per a l'elevada afinitat de l'adenofostina. També s'ha confirmat la presència de la intercció catió- al centre d'unió del receptor.El segon punt de l'estudi presentat ha estat el disseny i la síntesi de nous anàlegs d'adenofostina basats en els resultats dels estudis biològics anteriorment mencionats.Així doncs, s'ha sintetitzat el precursor d'un anàleg d'adenofostina que incorpora un àtom de flúor a la posició C-2'' amb la finalitat de conferir-li major estabilitat a l'enllaç glicosídic i evaluar el paper del grup 2''-OH en la formació de ponts d'hidrogen. La introducció del flúor a l'estructura de l'adenofostina es va dur a terme mitjançant la fluoració electròfila del 3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucal amb Selectfluor®. El qual, posteriorment, es va convertir en el corresponent bromur de glicosil.Per altra banda, l'adenosina va ser convenientment protegida i utilitzada com a acceptor de glicosil amb el fragment fluorat. Els següents passos posteriors a la glicosilació foren la manipulació de grups protectors amb la finalitat d'obtenir el substrat apropiat par a la introducció dels grups fosfat a les posicions desitjades (2', 3', 4'').Així també, considerant el paper secundari del fosfat 2' en l'activitat de l'adenofostina, ens vam centrar en la síntesi de dos nous anàlegs en els quals els grups fosfat de les posicions 3'' i 4'' van ser substituits per un grup metilencarboxilat. Així, a banda d'incorporar funcionalitats no metabolitzables, la substitució alternada permetria saber el paper de cadascún dels fosfats en la unió amb el receptor. L'estructura bàsica per als dos anàlegs es va obtenir de la glicosilació de l'adenosina convenientment protegida amb un tioglicosid que incorporava la unitat metilencarboxilat en la seva estructura. El methyl (4,6-O-benzilidene)-1-O--glucòsid va ser el matrial de partida per a la síntesi dels dos fragments de carbohidrat, els quals es van obtenir variant la seqüència de grups protectors utilitzada.La introducció del precursor de la unitat metilencarboxilat a les unitats de carbohidrat es va fer mitjançant al·lilació radicalària, obtenint-se els al·lil derivats amb la estereoquímica desitjada. La posterior ruptura oxidativa del grup al·lil donà lloc a l'àcid. Les etapes finals de la síntesi dels fragments de carbohidrat implicaven la hidròlisi de la posició anomèrica i la formació del tioglicòsid. Finalment, els tioglicòsids així obtinguts es van fer reacionar amb el derivat d'adenosina obtenint-se l'estructura bàsica per tots dos anàlegs. Després de vàries etapes de desprotecció, es van obtenir els substrats apropiats per a la fosforilació.En resum, el present treball ha permès:1. Establir les característiques estructurals que confereixen a les adenofostines la seva elevada activitat, fins i tot superior a la del propi IP3.2. Sintetitzar els precursors de tres nous anàlegs d'adenofostina els quals presenten modificacions estructurals que haurien de permetre: a) saber el paper independent de cadascún dels fosfats en el producte natural; i b) saber el paper del grup 2''-OH en les interaccions amb el receptor.