Utilidad y aplicación de diferentes técnicas (bioquímicas, proteómicas y moleculares) en la caracterización de Leishmania

Resumen

Las leishmaniosis son enfermedades causadas por el género Leishmania. Mientras que la clínica visceral se asocia al complejo L. donovani, la clínica tegumentaria puede estar producida por cualquier especie que afecte al humano. En España, el agente etiológico autóctono es L. infantum. Sin embargo, en las últimas décadas se han reportado casos importados asociados a otras especies. Dado que la especie causal puede influir en la evolución de la enfermedad, la identificación de la especie de Leishmania es especialmente útil en el ámbito asistencial, pero la compleja taxonomía del género y las discrepancias en cuanto a la validez de algunas especies pueden dificultar esta tarea. Actualmente, existe un amplio abanico de técnicas con diferentes características en cuanto a poder de discriminación, sencillez, coste etc. El objetivo de este trabajo ha sido la evaluación de distintas metodologías −electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), secuenciación de distintas regiones genéticas y espectrometría de masas MALDI-TOF−, para abordar cuestiones como la controversia en la taxonomía del complejo L. donovani y la etiología y la epidemiología de la leishmaniosis tegumentaria en Cataluña. Se colaboró en la evaluación de una librería de espectros de referencia MALDI-TOF de Leishmania, accesible a través de una aplicación web gratuita. Esta, resultó ser una herramienta rápida y sencilla para la identificación de las leishmanias a nivel de especie, a pesar de que se observó riesgo de identificación incorrecta en el seno de los complejos más controvertidos. Se profundizó en el estudio del complejo L. donovani, analizando una representación de cepas previamente caracterizadas por MLEE como L. infantum, L. donovani y L. archibaldi, aisladas en 20 países, de humanos, reservorios y vectores. Se realizó la electroforesis de la enzima GOT, la secuenciación de los genes hsp70 y got y el MALDI-TOF. Además, se utilizaron secuencias obtenidas en un análisis de secuencias multilocus previo y la información completa del MLEE. Los resultados mostraron discrepancias entre los métodos basados en el estudio de la GOT y el resto. En la estructura del complejo, se observó poca variabilidad genética junto con indicios de intercambios genéticos en un gradiente este-oeste a través del área de distribución. Se detectó la dispersión a gran escala de genotipos concretos y la presencia de ecotipos. En conjunto, los marcadores utilizados no mostraron suficientes evidencias genéticas para separar L. infantum de L. donovani. Se estudió la etiología y la epidemiología de la leishmaniosis tegumentaria en Cataluña, a partir de cepas aisladas en los últimos 40 años en la región. Al mismo tiempo, se realizó una comparativa de la utilidad de diversas metodologías −MLEE, secuenciación de los genes hsp70, rpoIILS, fh y la región ITS2 y MALDI-TOF− para este propósito. Todas las técnicas ofrecieron identificaciones coincidentes a nivel de complejo, pero con distinto poder de discriminación. Los casos autóctonos fueron causados por L. infantum, existiendo una cepa tipo predominante y presente a lo largo del periodo. Los casos importados estaban causados por L. braziliensis, L. guyanensis, L. panamensis, L. tropica y L. major. Se identificaron cuatro zimodemas nuevos (MON-327−MON-330) en cepas procedentes de América Latina. Los resultados enfatizan la importancia de la identificación de la especie causal, especialmente en inmigrantes o en aquellos casos con historial de viaje. En conclusión, las técnicas de identificación aportan información relevante en contextos tan distintos como el asistencial, el taxonómico o el epidemiológico. No obstante, el MALDI-TOF y la secuenciación de los genes rpoIILS y fh serían técnicas más adecuadas para la práctica clínica por su rapidez y sencillez, mientras que la secuenciación del gen hsp70 y la región ITS2, al ofrecer mayor poder de discriminación, podrían substituir al MLEE en los estudios epidemiológicos