Estudio fotofísico de nuevas sondas fluorescentes y su aplicación en sistemas biológicos de interés biomédico

Resumen

El principal tema de investigación de esta Tesis es el estudio de nuevas y diferentes sondas y su aplicación en procesos biológicos a través de la innovadora técnica de microscopía de fluorescencia como es la microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM). Las técnicas de fluorescencia, y en particular la microscopía, representan un método no invasivo caracterizado por su baja toxicidad, proporcionando un gran número de ventajas entre las que se incluyen un alto nivel de sensibilidad, especificidad y un amplio rango de concentración. Este trabajo puede dividirse en el estudio de dos tipos diferentes de fluoróforos, las sondas sensibles al medio ambiente, incluyendo los colorantes solvatocrómicos y fluorogénicos, y las sondas de larga duración, como los biosensores basados en lantánidos, con sus aplicaciones biomédicas. En el primer grupo, hemos incluido dos sondas diferentes; una es un derivado de xanteno modificado con silicio (2-4-TM), que presenta unas fuertes propiedades solvatocrómicas capaces de detectar cambios en la polaridad de su entorno. Durante el estudio de sus propiedades solvatocrómicas descubrimos una unión de adsorción natural de este derivado de xanteno modificado con silicio a macroestructuras. La combinación de estas propiedades nos permitió detectar en tiempo real los cambios en la polaridad del entorno alrededor del colorante durante las etapas iniciales del proceso de agregación del β-amiloide (Aβ), utilizando la espectroscopia de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo y técnicas avanzadas de obtención de imágenes de fluorescencia como FLIM. Mediante el uso de FLIM como un excelente enfoque para el estudio de la agregación amiloidogénica como método de detección no invasivo, pudimos establecer una escala de polaridad para distinguir la hidrofobicidad de los agregados y diferenciar entre los diferentes tipos de agregados Aβ-42 preamiloides. Las primeras etapas del proceso de agregación del péptido β-amiloide (Aβ) son de especial interés para comprender el origen de múltiples trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer, un importante problema de salud pública que afecta a millones de personas en todo el mundo y que sigue aumentando de forma espectacular. El segundo fluoróforo incluido en las sondas sensibles al medio consiste en la sonda basada en emisión inducida por agregación (AIE, por sus siglas en inglés), denominada PEMC. Tras estudiar sus propiedades solvatocrómicas, descubrimos que presentaba preferencias por medios no polares, exhibiendo AIE en condiciones específicas por inmovilización. Esto nos permitió estudiar su tasa de incorporación espontánea en las células mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia y observar su patrón intracelular producido por la AIE. Curiosamente, las fuertes diferencias en la intensidad y el tiempo de vida de fluorescencia de los diferentes compartimentos intracelulares facilitaron un aislamiento selectivo para el estudio detallado de orgánulos específicos, como el citoplasma, las mitocondrias y las estructuras periféricas de F-actina en la membrana plasmática. Dado que los orgánulos de las células eucariotas desempeñan un papel fundamental en la función celular, la importancia de visualizar y controlar la morfología y los cambios de actividad de determinados orgánulos proporciona información muy útil a nivel subcelular y molecular en el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades. En lo que respecta a las sondas de larga duración, hemos realizado el estudio de un biosensor basado en lantánidos, que consiste en una pequeña molécula que se comporta como un aceptor de Michael reactivo no fluorescente, que al reaccionar con tioles se vuelve fluorescente, y una antena eficiente de Eu3+, que tras autoensamblarse con este catión en agua representa un logro muy innovador y químicamente interesante en la detección de biotioles, y específicamente de glutatión (GSH). El comportamiento de nuestro biosensor altamente selectivo de GSH mostró un alto potencial para estudios en células murinas y humanas del sistema inmune (células T CD4+, T CD8+ y B) por citometría de flujo, siendo capaz de capturar las diferencias basales en sus niveles de GSH intracelular. Nuestro biosensor también fue capaz de monitorizar con éxito los cambios intracelulares de GSH asociados a las variaciones metabólicas que rigen la inducción de las células T naïve CD4+ en células T reguladoras (Treg).