Estudio de "G-quadruplexes" del ADN en cáncer colorrectal y su uso como diana terapéutica

Resumen

Los cuartetos de guanina (G4) del ADN son estructuras no canónicas formadas mediante el autorreconocimiento de cuatro guaninas en tétradas que se apilan entre sí. Los G4s son muy frecuentes en regiones reguladoras del genoma. En numerosos estudios, se ha relacionado la formación de G4s con procesos biológicos clave que abarcan desde el mantenimiento de los telómeros y la transcripción hasta la inestabilidad genómica y el cáncer. En concreto, el cáncer colorrectal (CRC) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado y constituye la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Se requieren nuevas opciones de tratamiento para el CRC. Para simular la progresión del CRC, establecimos un modelo celular incluyendo la etapa no tumoral, de tumor primario y metastásica. A pesar de que las helicasas implicadas en desenrollar G4s se sobreexpresaron en CRC, la estabilización de los G4s y la inducción del daño en el ADN aumentaron a lo largo de la progresión del CRC tanto en la fase G0/G1 como S. Identificamos una asociación entre la presencia de G4s y la acumulación de roturas de doble cadena del DNA en su vecindad. El estado de plegamiento de los G4s desempeñó un papel en la expresión anormal de genes relevantes en CRC como CMYC. El G4 que se encuentra en su región promotora no estaba mutado. Varios ligandos de G4s conocidos provocaron citotoxicidad, careciendo de selectividad para células tumorales. Por una parte, examinamos la actividad antitumoral en CRC de varias diimidas de naftaleno (NDIs), un tipo de ligandos de G4s. Identificamos el compuesto T5 que inhibió de manera potente y selectiva el crecimiento celular tumoral mediante la unión a G4s presentes en el DNA ribosómico con gran afinidad, afectando así a la elongación por la RNA polimerasa I (Pol I). En consecuencia, T5 provocó una inhibición rápida de la transcripción por Pol I, desorganización del nucleolo, degradación vía proteasoma de la subunidad A catalítica de Pol I y autofagia. Asimismo, atribuimos una mayor selectividad de T5 para las células tumorales a que, al tratarse de un compuesto conjugado con carbohidrato, se captaría preferentemente por células tumorales que sobreexpresan el transportador de glucosa 1. Asimismo, demostramos sucintamente en una cohorte de pacientes con CRC que T5 podría ser explorado como agente terapéutico. Por otra parte, analizamos el potencial antitumoral en CRC de varios compuestos fenólicos naturales. Seleccionamos el ácido gálico (GA) como el mejor candidato en términos de potencia y selectividad. Demostramos el papel del GA como ligando de G4s, lo que explica varios de sus efectos antitumorales, incluida la inhibición transcripcional de los genes ribosomales y de CMYC. Además, el GA compartió varios efectos con otros ligandos de G4s conocidos como son la detención del ciclo celular, estrés nucleolar, inducción del daño en el DNA y de autofagia. Utilizando un modelo de xenógrafo de CRC, confirmamos que el GA poseía efecto antitumoral y estabilizador de G4s in vivo. También demostramos concisamente que el tratamiento con GA podría explotarse en una cohorte de pacientes con CRC. Finalmente, generamos una batería de nanoanticuerpos dirigidos a G4s mediante inmunización in vitro. Los nanoanticuerpos se producen a partir de anticuerpos de cadena pesada de camélidos por ingeniería genética. Aunque estos nanoanticuerpos presentaron reactividad cruzada con diferentes estructuras de G4, los nanoanticuerpos dirigidos específicamente al G4 de CMYC se enriquecieron a través de “biopanning” con disposición en fagos. En general, en la presente tesis doctoral, hemos analizado la implicación de los G4s en la carcinogénesis colorrectal y hemos investigado el potencial terapéutico de varios ligandos de G4s en CRC. Hemos desvelado un mecanismo de acción para los NDIs que involucra su acción sobre los G4s del DNA ribosómico y que el GA afecta la expresión génica interaccionando con G4s tanto in vitro como in vivo.