Genetic and genomic analysis of the contribution to virulence of the pseudomonas syringae type iii effector inventory

Laburpena

Pseudomonas syringae es un patógeno vegetal ubicuo que infecta a cientos de especies de plantas. El rango de hospedador en P. syringae está determinado principalmente por los efectores que secreta cada aislado bacteriano. Los efectores son proteínas en su mayoría translocadas desde el citosol bacteriano hasta el citosol de la célula de la planta huésped, a través del sistema de secreción tipo III (T3SS). El T3SS es una estructura proteica compleja, altamente conservada. El silenciamiento génico se identificó y caracterizó por primera vez en plantas. Desde entonces, ha sido descrito en una amplia gama de organismos eucariotas, incluyendo hongos, gusanos, insectos y vertebrados. El término silenciamiento génico engloba todos los mecanismos que utilizan pequeños RNAs interferentes (siRNAs) y microRNAs (miRNAs) para reducir la expresión génica a nivel transcripcional o post-transcripcional. La regulación de la expresión de genes por pequeños RNAs juega un papel muy importante en el desarrollo, y el mantenimiento de la integridad del genoma, siendo a su vez aún componente integral de las respuestas de las plantas a condiciones ambientales adversas, incluyendo estrés biótico. Uno de los principales objetivos de esta tesis es establecer los medios por los cuales abordar el análisis de las relaciones funcionales entre los efectores translocados del sistema de secreción tipo III de P. syringae, para lo cual se optó por utilizar Pph 1448a y su interacción con la planta huésped, judía, como nuestro modelo. Analizamos qué efectores candidatos se expresan y son translocados a la céluda huésped, y usando un método simplificado para la generación rápida de mutantes knock-out desarrollado en este trabajo, se generó mutantes sencillos de los efectores de Pph 1448a. Estos se generaron de forma que permite su fácil combinación en mutantes dobles o múltiples. Los resultados obtenidos han permitido establecer contribución individual a la virulencia para un porcentaje mayor del conjunto de efectores tipo III de Pph 1448a que en ningún otro trabajo previo de P. syringae. Para determinar las relaciones funcionales entre éstos, utilizamos ensayos de competitividad en infección mixta, y llevamos a cabo el análisis genético de las relaciones funcionales entre los efectores Pph 1448a. Nuestros resultados ponen de manifiesto el potencial de la diversidad de las relaciones funcionales mostradas por los efectores de un patógeno dado. El segundo gran objetivo de este trabajo es la utilización de datos transcriptomicos para analizar el potencial solapamiento funcional entre la defensa de la planta frente a P. syringae y los mecanismos de silenciamiento de la planta. Utilizamos datos de análisis por microarray de la respuesta de la planta a la infección por P. syringae y un mutante en el T3SS, así como datos de plantas mutantes o transgénicas alteradas en silenciamiento. Los diferentes conjuntos de genes desregulados se compararon por parejas, y el número de genes compartidos entre cada dos experimentos significativamente más alto de lo esperado por azar. Estos resultados apoyan la hipótesis de que existe un solapamiento funcional entre la respuesta de la planta a bacterias y el silenciamiento génico. En el análisis encontramos un significativo enriquecimiento en términos asociados a jasmonato en los genes desregulados tanto por las infecciones bacterianas como por el silenciamiento génico. Este hallazgo parece indicar que las respuestas de jasmonato están directa o indirectamente reguladas por silenciamiento génico.