Identificación de la heterogeneidad molecular asociada a la enfermedad cardiovascular, la evolución clínica y la respuesta terapéutica en patologías autoinmunes sistémicas

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis Las enfermedades autoinmunes son enfermedades multifactoriales, resultado de la interacción entre factores genéticos, factores ambientales y alteraciones del propio sistema inmune. Entre ellas, el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR) son enfermedades autoinmunes sistémicas que comparten una etiología autoinmune, pero difieren en los mecanismos inmunológicos, determinantes de sus distintas manifestaciones clínicas. Ambas enfermedades muestran un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular (ECV). La inflamación y los elementos autoinmunes presentes en estas patologías, tales como los autoanticuerpos, la activación endotelial, el estrés oxidativo y la función alterada de las células inmunes, parecen ser los principales factores desencadenantes de la ECV. No obstante, las características específicas que definen cada enfermedad pueden asimismo contribuir a determinar mecanismos únicos de ECV en cada condición autoinmune. Por tanto, la caracterización de la base molecular de las anomalías que conducen a la autoinmunidad y la inflamación son fundamentales para la comprensión de la patogénesis del LES y la AR. Estudios recientes en análisis genómicos y epigenéticos [metiloma y microRNAs (microRNAs)] han permitido identificar firmas específicas en dichas enfermedades autoinmunes y obtener información sobre los mecanismos subyacentes al desarrollo de comorbilidades asociadas. Además, se han caracterizado diversos miRNAs implicados en el control de proteínas asociadas al estatus proinflamatorio, el riesgo CV y la respuesta terapéutica en pacientes con LES y AR. Asimismo, numerosas evidencias derivadas de otros estudios han demostrado la implicación directa de las células del sistema inmune (linfocitos T y B, células dendríticas, monocitos y neutrófilos), los autoanticuerpos y el perfil inflamatorio específicos del LES y la AR en la patogenia, el desarrollo de ECV, la evolución clínica y la respuesta terapéutica en pacientes autoinmunes. Durante la evolución clínica de estas enfermedades, asociados a la ocurrencia de brotes, daño orgánico y eventos cardiovasculares, la identificación de dichos cambios moleculares podría asimismo ayudar a discernir los mecanismos implicados en estos procesos. Se ha demostrado también la eficacia del uso de terapias biológicas en el LES y la AR. No obstante, su efecto sobre la patología CV está aún poco definido. Estudios longitudinales de seguimiento clínico/molecular, y respuesta a nuevas terapias aportarían información valiosa para identificar dichos cambios, lo que podría favorecer la toma de decisiones clínicas. En base a estas premisas, el Objetivo Principal de esta tesis doctoral es caracterizar los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo de las EAS, sus comorbilidades y respuesta terapéutica, a fin de identificar las causas de su heterogeneidad clínica y favorecer el desarrollo de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas útiles para su seguimiento clínico y manejo terapéutico. 2.contenido de la investigación Principales resultados obtenidos: 1. Hemos demostrado por primera vez el papel relevante de los anticuerpos anti-dsDNA como un responsable más que contribuye al aumento del riesgo CV en pacientes con LES. Mediante el uso de aproximaciones transcriptómicas y proteómicas, hemos caracterizado in vivo e in vitro los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos de estos autoanticuerpos sobre la actividad específica de las células inmunitarias y vasculares, que conducen al aumento del riesgo CV presente en dichos pacientes. La positividad y persistencia de anticuerpos anti-dsDNA en pacientes con LES se asoció a disfunción endotelial, dislipidemia proaterogénica y aterosclerosis acelerada. Paralelamente, los anticuerpos anti-dsDNA se relacionaron con la activación aberrante de las células inmunitarias innatas, de modo que los monocitos de pacientes con LES positivos para la presencia de anticuerpos anti-dsDNA mostraron perfiles distintivos de expresión y actividad alterada de genes y proteínas, mientras que los neutrófilos fueron más propensos a sufrir NETosis en comparación con pacientes con LES negativos para anticuerpos anti-dsDNA. Pacientes con anticuerpos anti-dsDNA también mostraron niveles alterados de numerosos mediadores circulantes relacionados con la inflamación, la NETosis y el riesgo cardiovascular. In vitro, anticuerpos anti-dsDNA aislados a partir del suero de pacientes, promovieron NETosis en neutrófilos y apoptosis en monocitos, moduló la expresión de moléculas relacionadas con la inflamación y la trombosis e indujo activación endotelial. Dichos efectos fueron promovidos en parte mediante mecanismos dependientes de unión a receptores Fc. En suma, se ha demostrado que los anticuerpos anti-dsDNA aumentan el riesgo cardiovascular en pacientes con LES al alterar los procesos moleculares clave que impulsan una activación inmune y vascular distintiva y coordinada, constituyendo una herramienta clínica adicional para el manejo de esta comorbilidad. 2. Hemos demostrado que la maquinaria de splicing está profundamente alterada en los leucocitos de pacientes AR y estrechamente relacionada con la fisiopatología de la enfermedad, lo cual no había sido descrito hasta la fecha. Identificamos ocho componentes (SNRNP70, SNRNP200 U2AF2, RNU4ATAC, RBM3, RBM17, KHDRBS1, SRSF10) comúnmente alterados en neutrófilos, monocitos y linfocitos, cuyos niveles de expresión permitieron distinguir a pacientes con AR de donantes sanos e identificar a pacientes con alta actividad de la enfermedad, afectación articular y aterosclerosis temprana. Además, ampliamos estas observaciones examinando la relación entre los niveles alterados de la maquinaria de splicing y mediadores inflamatorios notablemente involucrados en el perfil clínico de estos pacientes. Estos resultados se validaron aún más en células mononucleares obtenidas del líquido sinovial de pacientes con AR, donde el daño inflamatorio es más pronunciado, y en las articulaciones de un modelo de ratón con AR, reforzando así la relevancia clínica de los datos obtenidos. Los estudios ex vivo e in vitro identificaron además los posibles mecanismos subyacentes a estos procesos. Por un lado, los anticuerpos ACPA y las citoquinas inflamatorias modularon la expresión de los componentes de la maquinaria de splicing. Po otro lado, la sobreexpresión inducida de SNRNP70 y KHDRBS1 revirtió la inflamación en los linfocitos, la NETosis en los neutrófilos y la adhesión en los monocitos de la AR, e indirectamente moduló la actividad de fibroblastos sinoviales (SF). Finalmente, la terapia anti-TNF a los tres y seis meses revirtió la expresión de algunos de los componentes de la maquinaria de splicing en paralelo a la reducción del perfil inflamatorio. En suma, hemos caracterizado por primera vez una firma que conforma 8 componentes de la maquinaria de splicing desregulados en leucocitos de AR tanto de sangre periférica como de líquido sinovial, vinculados a la fisiopatología de la enfermedad, modulados por ACPA y revertidos por la terapia anti-TNF. 3. Hemos caracterizado molecularmente pacientes AR que inician tratamiento con terapia anti-TNF, incluidos en un estudio multicéntrico, identificando subgrupos de pacientes cuyo perfil molecular circulante se asoció a la respuesta terapéutica tras 6 meses de tratamiento. En concreto, se encontraron biomoléculas alteradas inflamatorias, oxidativas y derivadas de NETosis en pacientes con AR en relación con donantes sanos, estrechamente interconectadas y asociadas con perfiles específicos de miRNA. Este perfil molecular alterado permitió la división no supervisada de tres grupos de pacientes con AR, que mostraron fenotipos clínicos distintivos, vinculados aún más a la eficacia de fármacos anti-TNF. Además, esta terapia revirtió dichas alteraciones moleculares en paralelo a la respuesta clínica. Mediante herramientas de aprendizaje automático (machine learning) se identificaron tanto firmas clínicas como moleculares como posibles predictores de la respuesta al tratamiento anti-TNF con alta precisión, la cual aumentó aún más cuando ambas características se integraron en un modelo mixto. Estos resultados se confirmaron en una cohorte independiente de validación. En su conjunto, estos datos sugieren que el análisis integrado de perfiles clínicos y moleculares utilizando herramientas computacionales avanzadas permite la identificación de firmas novedosas como posibles predictores de la respuesta terapéutica a la terapia anti-TNF. 3.conclusión En conclusión, los resultados globales obtenidos en esta tesis doctoral han permitido identificar potenciales biomarcadores del estatus de la enfermedad, sus comorbilidades asociadas y la respuesta a determinadas terapias en pacientes con LES y AR, así como diversos mecanismos moleculares asociados a procesos patológicos clave en estas enfermedades. Dichos resultados podrían sentar las bases para la realización de futuros estudios, cuyo fin sea desarrollar una medicina personalizada dirigida a optimizar el cuidado de pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas. 4. bibliografía 1. 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