Gut microbiome-intestinal barrier crosstalk during Iron deficiency anaemia: use of nutrition-based Strategies

Resumen

La anemia es un síndrome plurietiológico caracterizado por un descenso en los niveles de hemoglobina por debajo de las concentraciones fisiológicas, que pueden variar de acuerdo a la edad, género o condición fisiológica. Se estima que afecta al menos a un tercio de la población mundial, con una prevalencia aumentada en países subdesarrollados, donde supone una carga económica considerable. La deficiencia de hierro es la causa más frecuente de anemia, produciendo aproximadamente el 50% de los casos, y considerándose la deficiencia de micronutrientes más prevalente a nivel mundial. La escasa variedad de alternativas terapéuticas es uno de los mayores problemas de la anemia ferropénica (AF). Los suplementos de hierro orales constituyen la primera línea de tratamiento a pesar de sus numerosos efectos adversos. Dado que la absorción de hierro en el intestino es muy limitada, el hierro de los suplementos que no ha sido absorbido se acumula en el intestino, produciendo estrés oxidativo y deteriorando el epitelio intestinal. El exceso de hierro también produce alteraciones en el microbioma. Por tanto, las alteraciones gastrointestinales son efectos adversos muy comunes de los suplementos de hierro, en muchas ocasiones causando el abandono del tratamiento cuando los síntomas de la anemia desaparecen pero antes de que los depósitos de hierro se recuperen completamente, lo que suele provocar recidivas. Un porcentaje considerable de las anemias ferropénicas acaban volviéndose refractarias al tratamiento y se cronifican. A pesar de que se conoce el efecto perjudicial de los suplementos de hierro para la salud intestinal, las cuestiones relacionadas con la alteración del microbioma y el estado del epitelio intestinal durante la AF todavía permanecen abiertas. El intestino humano alberga la comunidad de microorganismos más amplia de todo el organismo. Durante los últimos años, se han establecido multitud de relaciones causales entre alteraciones del microbioma intestinal y cambios en el estado de salud. Algunos de estos estudios analizan las alteraciones microbiológicas a nivel intestinal durante la AF y sugieren que los microorganismos podrían estar contribuyendo a la génesis de la AF al competir por el hierro con las células del hospedador o alterar la homeostasis intestinal. La mayoría de los estudios se centran en el microbioma del intestino grueso y las heces y no utilizan las nuevas metodologías de secuenciación masiva. El microbioma intestinal es un componente clave de la barrera intestinal, ya que la disbiosis intestinal suele asociarse con alteraciones de dicha barrera. En condiciones fisiológicas, existen una gran variedad de antígenos, toxinas y microorganismos en el lumen intestinal y la función de la barrera es prevenir su paso a la circulación sistémica. Existen evidencias en la bibliografía de que un paso incrementado del contenido del lumen a los tejidos puede desencadenar inflamación y agravar ciertas enfermedades. La barrera intestinal apenas ha sido estudiada en el contexto de la AF, a pesar de que se conoce que la falta de hierro puede dificultar la replicación del ADN y el ciclo celular. Dado que abordar el deterioro del microbioma y de la barrera intestinal sería una de los objetivos a la hora de optimizar las terapias de la AF, la leche fermentada de cabra se ha estudiado como una estrategia nutricional para restaurar la salud intestinal en este contexto. El alto valor nutricional de la leche de cabra junto con su reducido riesgo de alergenicidad la sitúa en un lugar aventajado para su uso en determinadas situaciones patológicas. Los oligosacáridos son los nutrientes de mayor interés desde el punto de vista microbiológico debido a su alto potencial prebiótico. Estos oligosacáridos se encuentran en mayor concentración en la leche de cabra que en la leche de otros animales, además de ser estructuralmente más diversos y guardar una gran similitud con los oligosacáridos de la leche materna humana, que constituye el patrón de referencia en cuanto a efectos beneficiosos intestinales. Por otro lado, la fermentación mejora la digestibilidad de la leche, sus características organolépticas y la biodisponibilidad de los oligosacáridos, aumentando su potencial prebiótico. Se ha demostrado que la leche de cabra aumenta la biodisponibilidad de hierro, pero se desconoce si este efecto depende de sus propiedades moduladoras del microbioma intestinal. Se ha descrito que los oligosacáridos de la leche de cabra ejercen efectos beneficiosos sobre el microbioma intestinal y la integridad de la barrera, pero los estudios sobre la leche fermentada de cabra son escasos. En la presente tesis se ha llevado a cabo una caracterización completa de las alteraciones del microbioma intestinal a lo largo del tracto digestivo durante la AF, así como un análisis en profundidad de la integridad de la barrera, para valorar el estado general de la salud intestinal. Además, se ha estudiado la capacidad de la leche fermentada de cabra para recuperar la AF, así como sus propiedades moduladoras sobre la composición del microbioma y la integridad de la barrera intestinal. La AF se indujo experimentalmente en un modelo animal mediante el uso de una dieta carente de hierro (AIN-93G sin hierro) durante un periodo de 40 días. Al final del periodo de inducción, parte de los animales se sacrificaron, obteniéndose las siguientes muestras biológicas: sangre total, suero, contenido y mucosa intestinal de cada segmento del tracto digestivo (duodeno, yeyuno, íleo, ciego y colon) y heces. Los animales restantes se sometieron a un periodo de tratamiento con dieta basada en leche fermentada de cabra o dieta estándar durante 30 días adicionales. Al terminar este periodo, los animales fueron sacrificados y se obtuvieron muestras biológicas similares. Para confirmar que la AF se había inducido correctamente en los animales de experimentación se realizó el estudio de parámetros hematológicos. El microbioma intestinal se analizó en el contenido de todos los segmentos intestinales (duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon) y en las heces. En una primera aproximación, se realizó la secuenciación de la subunidad 16S del ARN ribosómico (secuenciación de amplicones) para identificar la región intestinal con mayor disbiosis. La secuenciación de amplicones demostró que existía una disbiosis intestinal en respuesta a la AF, más intensa hacia el intestino grueso (ciego y colon). Se realizó un análisis predictivo funcional sobre los datos de secuenciación que reveló que las rutas metabólicas microbianas más enriquecidas en el intestino grueso durante la AF estaban relacionadas con el metabolismo de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC). La determinación de estos metabolitos (ácidos butírico, propiónico y acético) confirmó un incremento de su concentración durante la AF, especialmente en el colon. De igual manera, el análisis taxonómico mostró un aumento de los miembros del género Clostridium en el intestino grueso de los animales anémicos, que estaban positivamente correlacionados con los niveles de ácido butírico y propiónico en el colon. El colon fue, por tanto, identificado como la región intestinal con la mayor disbiosis para llevar a cabo un análisis detallado del microbioma intestinal mediante secuenciación de metagenoma completo (secuenciación shotgun). Se confirmó un aumento de especies del género Clostridium, positivamente correlacionadas con los niveles de ácido butírico y propiónico, así como un aumento de vías microbianas productoras de AGCC, nucleótidos y un aumento de la carga bacteriana durante la AF. Así, especies clave del género Clostrdium y metabolitos clave fueron identificados como los principales contribuyentes a la disbiosis producida en respuesta a la AF. Dadas sus funciones beneficiosas en el epitelio intestinal, es muy probable que los AGCC formen parte de mecanismos de compensación desencadenados como consecuencia de la AF para aliviar las alteraciones sistémicas o intestinales derivadas de la enfermedad. El análisis de la barrera intestinal en la mucosa del colon mediante secuenciación de ARN mensajero mostró un epitelio intestinal infradesarrollado debido a la infraexpresión de términos Gene Onthology (GO) relacionados con el desarrollo y la señalización sináptica del sistema nervioso entérico, desarrollo del tracto digestivo, ensamblaje de las uniones celulares e integridad celulares y organización de la matriz extracelular. Dado que el metabolismo del colágeno, como componente mayoritario de la matriz extracelular, es dependiente de hierro, se analizaron específicamente genes y proteínas relacionados con el colágeno, encontrando niveles disminuidos durante la AF. Debido a la estrecha relación existente entre los AGCC y la estabilización de la hipoxia intestinal y al papel de la hipoxia en el mantenimiento de la barrera intestinal, se analizaron específicamente genes diana de hipoxia mediante PCR cuantitativa. La ausencia de diferencias en la expresión entre los grupos experimentales control y anémico sugiere que la alteración observada en la barrera intestinal es independiente de hipoxia. Por último, el aumento en los marcadores de translocación microbiana (lipopolisacárido bacteriano e inmunoglobulinas específicas de bacterias) en los animales anémicos apoya la falta de integridad de la barrera intestinal durante la AF. Durante el periodo de tratamiento con las dietas a ensayar, la determinación de parámetros hematológicos mostró que la AF se recuperó más eficientemente con la dieta basada en leche fermentada de cabra respecto a la estándar. Las propiedades moduladoras del microbioma intestinal de la leche fermentada de cabra se estudiaron en contenidos intestinales de todos los segmentos del tracto digestivo recolectados tras el periodo de tratamiento. La dieta basada en leche fermentada de cabra dio lugar a un microbioma más diverso en cuanto al número de especies en la comunidad microbiana, y funcionalmente más activo que la dieta estándar, tanto en el intestino delgado como en el grueso de animales controles, lo que está en línea con una recuperación más eficiente de la AF. En cuanto a sus propiedades restauradoras del microbioma intestinal, tanto la dieta basada en leche fermentada de cabra como la dieta estándar recuperaron la disbiosis asociada a la AF del intestino delgado. Sin embargo, la dieta basada en leche fermentada de cabra fue más eficiente al recuperar la disbiosis más intensa del colon, confirmando sus propiedades prebióticas. En ningún caso se recuperó completamente el microbioma en los animales anémicos en relación al grupo control en durante el periodo de tratamiento empleado. Por último, la dieta basada en leche fermentada de cabra no mostró ningún efecto positivo adicional sobre la integridad de la barrera intestinal comparada con la dieta estándar. Ambas dietas recuperaron los genes infraexpresados afectados durante la AF, restaurando la función de la barrera intestinal. La ausencia de diferencias significativas entre las concentraciones séricas de lipopolisacárido bacteriano entre el grupo control y el anémico alimentados con dieta basada en leche fermentada de cabra o dieta estándar sugiere un estado similar de integridad de la barrera intestinal tras el tratamiento con ambas dietas. En esta tesis se han analizado las alteraciones del microbioma y la barrera intestinal en un modelo animal representativo de una anemia ferropénica nutricional. Con el descubrimiento de una disbiosis intestinal intensa en el intestino grueso con un aparente papel compensador y un estado deteriorado del epitelio intestinal que genera translocación de componentes bacterianos, adoptar nuevas aproximaciones de tratamiento para la AF enfocados a la restauración de la salud intestinal parece de gran importancia. La leche fermentada de cabra se ha estudiado en este sentido, recuperando la AF y restaurando la disbiosis colónica más eficientemente que una dieta estándar; a pesar de que la dieta basada en leche fermentada de cabra también recuperó la integridad de la barrera intestinal, no mostró ningún efecto positivo adicional frente a la dieta estándar. Por tanto, la leche fermentada de cabra podría ser una estrategia nutricional prometedora para aliviar las alteraciones intestinales durante la AF y para reducir el impacto negativo de los suplementos de hierro en la salud intestinal.