Caracterización y aplicación del reactor flujo de vórtices enfocado a la adsorción y purificación de proteínas

Abstract

Este trabajo tiene como objetivo principal llevar a cabo el diseño, caracterización y evaluación del reactor de flujo de vórtices (RFV) para su aplicación en la cromatografía de adsorción en lecho expandido (LE) de biomoléculas, específicamente proteínas. El mercado de las proteínas está en continuo crecimiento, especialmente por la creciente demanda del mercado de las proteínas terapéuticas, (como los anticuerpos monoclonales) o las proteínas utilizadas en pruebas diagnósticas (como la β-ficoeritrina, B-PE), estando la sofisticación de sus aplicaciones claramente asociada a su grado de pureza. Habitualmente, la etapa de purificación incluye un considerable número de etapas previas, con la finalidad de acondicionar el alimento que contiene la proteína según las condiciones requeridas. Esto incrementa significativamente los tiempos de procesado y los costes del proceso, suponiendo entre el 50 y el 80% de los costes totales del bioproducto. Además, disminuye el rendimiento del proceso, ya que las operaciones preliminares pueden repercutir en una pérdida importante del producto. De este modo, la innovación y optimización del proceso productivo para la purificación de proteínas, persigue simplificar el número de etapas, obteniendo productos de alta pureza con altos rendimientos al menor coste posible. Específicamente, se utiliza la cromatografía de adsorción como una tecnología que viene a solucionar los problemas que supone la alimentación de extractos que contienen partículas sólidas o fluidos viscosos. En las secciones iniciales del cuerpo de este trabajo, apartados 4.1.1 y 5.1, se describe la invención del RFV para su aplicación en procesos de purificación de proteínas. El RFV está formado por dos cilindros concéntricos, entre los cuales se expande el lecho de partículas de adsorbente. El flujo axial facilita la expansión del lecho para mejorar el contacto alimento-adsorbente y la rotación del cilindro interno permite mejorar la fluidodinámica del sistema, para favorecer la transferencia de materia, evitando canales preferentes. La rotación del cilindro interno está siempre por encima de la rotación crítica, a partir del cual, en la zona anular se forman vórtices, que son los responsables de la mejora de la eficacia de la adsorción. La rotación del cilindro interno interviene en el número de Taylor adimensional (Ta) y la rotación critica en el número de Taylor critico (Tac). El reactor de flujo de vórtices en lecho expandido (RFVLE) trabaja con relaciones Ta/Tac > 1 para asegurar la formación de los vórtices. El RFV permite la introducción del alimento sin la necesidad de ser pre-tratado, lo cual contribuye a aumentar la eficacia y rendimiento del proceso. A continuación, en los apartados 5.2 y 5.3, se caracteriza la fluidodinámica del sistema, centrada en la etapa de adsorción. La relación de aspecto entre la altura del lecho expandido y el espacio anular (entre ambos cilindros del reactor), así como la velocidad de rotación y la velocidad axial del fluido que pueden imponerse al sistema, permiten un ajuste preciso de las condiciones fluidodinámicas. Se persigue identificar, de forma teórica o mediante estudio visual, un régimen de vórtices de Taylor en el lecho, acompañado de un comportamiento flujo pistón del reactor. Seguidamente, en el apartado 5.4, se caracteriza la transferencia de materia durante la adsorción trabajando en el régimen fluidodinámico establecido. A continuación, en el apartado 5.5, se realiza la purificación de proteínas en dos procesos que parten de alimentos de características diametralmente opuestas: en un caso se utiliza un extracto concentrado de células rotas para exponer la proteína intracelular (B-PE) al adsorbente, y en el otro, un caldo de cultivo que contiene una baja concentración de anticuerpo extracelular (IgG2a) en un gran volumen de fluido. Finalmente, se aborda un estudio de viabilidad del RFV (apartado 5.6) y los criterios que se estima necesario considerar para poder escalar el RFV a otros requerimientos de producción (apartado 5.7). El plan experimental para abordar este trabajo se resume a continuación: 1) Diseñar el reactor flujo de vórtices a partir de datos bibliográficos. 2) Caracterizar el rango de condiciones de operación que influyen de forma directa en el comportamiento del RFV con el fin de lograr un proceso eficiente con un elevado rendimiento. Para ello se estudian:  La estabilidad del lecho expandido.  El régimen laminar de vórtices de Taylor de forma teórica y visual.  El comportamiento fluidodinámico mediante el modelo de dispersión axial.  La transferencia de materia en la etapa de adsorción. 3) Aplicar el RFV-LE para reducir el número de etapas. Se plantea y estudia tanto a proteínas intracelulares como extracelulares. Con este fin se realizan dos evaluaciones: a) Evaluación de la eficacia del sistema diseñado en la adsorción de proteínas de síntesis intracelular, concretamente la proteína B-PE, abordando:  La producción de B-PE a partir del cultivo de P. cruentum.  La ruptura celular y extracción de B-PE mediante ciclos de congelación-descongelación.  La caracterización reológica del extracto concentrado de B-PE.  La adsorción y elución de B-PE en el RFV mediante el adsorbente Streamline DEAE. b) Evaluación de la eficacia del RFV diseñado en la adsorción y purificación de anticuerpos excretados al medio de cultivo, concretamente el anticuerpo IgG2a, abordando:  La producción del anticuerpo IgG2a a partir de hibridomas de ratón.  La determinación del pH de elución del anticuerpo.  La adsorción y elución de IgG2a en el RFV mediante el adsorbente Streamline rProtein A. 4) Evaluar la viabilidad operativa del RFV-LE para la purificación de proteínas. 5) Analizar el posible escalamiento del RFV para discernir su posible viabilidad. Los resultados obtenidos muestran que, el RFV diseñado puede trabajar en régimen de flujo de vórtices a velocidades axiales entre 200 y 300 cm·h-1, con alturas de lecho expandido entre 20 y 30 cm y relación Ta/Tac entre 1,2 y 2,6. Las condiciones de operación, que se establecen para las dos aplicaciones evaluadas, son de una altura del lecho sedimentado de 20 cm, una relación Ta/Tac = 1,5 y una velocidad del flujo axial de 200 y 300 cm·h-1 para la purificación de B-PE y IgG2a, respectivamente. En definitiva, se demuestra que, la rotación del cilindro interno del RFV, permite establecer un régimen de vórtices de Taylor que favorece la transferencia de materia durante la adsorción y admite utilizar alimentos sin clarificar. La combinación entre la velocidad de rotación y velocidad de flujo axial establecidas, permite ajustar los tiempos de residencia manteniendo un lecho fluidizado estable. En conclusión, la utilización del RFV reduce el número de etapas previas a la purificación, obteniéndose biomoléculas de alta pureza con altos rendimientos: 78,1% de B-PE con pureza igual o superior al 95% y 93,1% de anticuerpo IgG2a de alta pureza.