Peripheral sigma-1 receptorsat the interface between nociceptor sensitization and immune cells

Résumé

El receptor sigma-1 es una proteína chaperona sensible al Ca2+ y regulada por ligandos, con la capacidad de unirse a varios receptores y canales iónicos actuando como una subunidad reguladora (Sánchez-Fernández et al., 2017). Los receptores sigma-1 han sido ampliamente estudiados por sus acciones a nivel del sistema nervioso central y su potencial como diana farmacológica para el tratamiento del dolor (Sánchez-Fernández et al., 2017). De hecho, el antagonista sigma-1 S1RA disminuye la sensibilización central en ensayos preclínicos (Sánchez-Fernández et al., 2017) y ha superado con éxito la fase IIa de ensayos clínicos en pacientes con dolor neuropático, siendo esta su indicación primaria (Bruna et al., 2018). La indicación secundaria del S1RA es la potenciación de la analgesia inducida por fármacos opioides, proceso en el cual el bloqueo de receptores opioides en el sistema nervioso central juega un papel relevante (Sánchez-Fernández et al., 2017). No obstante, nuestro grupo de investigación ha descrito que el receptor sigma-1 se expresa mayoritariamente en las neuronas sensoriales periféricas, situadas en los ganglios de las raíces dorsales (DRG, de sus siglas en inglés Dorsal Root Ganglia) (Sánchez-Fernández et al., 2017; Montilla-García et al., 2018) y que la inhibición sigma-1 incrementa la analgesia opioide periférica, inducida tanto por fármacos opioides como por péptidos opioides endógenos de origen inmunitario (Sánchez-Fernández et al., 2017; Tejada et al., 2018), lo que muestra el potencial de los receptores sigma-1 periféricos como diana analgésica. Sin embargo, el papel de los receptores sigma-1 en la sensibilización periférica está inexplorado, por lo que nuestro primer objetivo fue evaluar la implicación de los receptores sigma-1 en la sensibilización inducida por sensibilizadores de distintos tipos de neuronas nociceptivas periféricas, e identificar los mecanismos subyacentes implicados. La sensibilización periférica se produce por algógenos químicos liberados durante el dolor patológico, tales como la prostaglandina E2 (PGE2), el factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), entre otros, los cuales actúan sobre los nociceptores produciendo hiperalgesia. No todos los sensibilizadores actúan en las mismas poblaciones neuronales. Mientras que la PGE2 y el NGF sensibilizan los nociceptores C peptidérgicos (TRPV1+), el GDNF sensibiliza nociceptores C no peptidérgicos (IB4+) (Woolf y Ma, 2007). Teniendo en cuenta estos antecedentes, estudiamos si los receptores sigma-1 son capaces de modular la hipersensibilidad inducida por PGE2, NGF y GDNF. Encontramos que la administración sistémica (subcutánea) o local (intraplantar) de los antagonistas sigma-1 S1RA y BD-1063, en ratones, revirtió la hiperalgesia mecánica (medida mediante el test de presión plantar) inducida por la administración intraplantar de la PGE2 y del NGF, pero no la hipersensibilidad mecánica inducida por el GDNF. El efecto antihiperalgésico de los antagonistas sigma-1 fue abolido por la administración del agonista sigma-1 PRE-084 (indicando la selectividad de dicho efecto), así como por el antagonista opioide periférico naloxona metiodida y el antagonista selectivo opioide µ ciprodime, pero no por el antagonista - nor-binaltorpimina ni por el antagonista - naltrindol. Estos resultados indican que el efecto antihiperalgésico de los antagonistas sigma-1 es mediado por la activación de los receptores opioides µ periféricos. Mediante ensayos inmunohistoquímicos, determinamos la presencia de los receptores sigma-1 en todas las neuronas sensoriales periféricas del ratón. También mostramos la presencia del agonista endógeno opioide µ endomorfina-2 (END2) en los nociceptores TRPV1+ pero no en los nociceptores IB4+. Dicha presencia fue confirmada usando el bisturí molecular resiniferatoxina (RTX), que eliminó selectivamente las neuronas TRPV1+ y con ello el marcaje de END2. Además, la administración de un anticuerpo frente a END2 en la pata sensibilizada revirtió el efecto antihiperalgésico inducido por los antagonistas sigma-1, indicando que la acción de este opioide endógeno es esencial para el efecto antihiperalgésico de los antagonistas sigma-1. Usando proteínas recombinantes, mostramos que el receptor sigma-1 puede unirse tanto al TRPV1 como al receptor opioide µ, y que el antagonismo sigma-1 induce el traslado de los receptores sigma-1 desde el TRPV1 al receptor opioide. Por lo tanto, el receptor sigma-1 podría participar en la comunicación entre el TRPV1 y el receptor opioide µ. La aplicación de PGE2 incrementó el flujo de calcio inducido por la capsaicina, el agonista prototipo TRPV1, en cultivos de neuronas del DRG. Este incremento en el flujo de calcio fue revertido por el S1RA, y de una manera sensible al antagonista opioide naloxona, lo que concuerda con los efectos opioides inducidos por antagonismo sigma-1 observados en los ensayos in vivo comentados anteriormente. En resumen, estos resultados sugieren que el antagonismo sigma-1 disminuye la sensibilización periférica mediante el incremento del tono opioide endógeno en las neuronas C peptidérgicas, que producen END2, mientras que no altera la sensibilización de los nociceptores C no peptidérgicos. Nuestro siguiente objetivo fue estudiar el proceso inverso. Es decir, los posibles efectos pronociceptivos de los agonistas sigma-1. El interés de este objetivo radica en la existencia de varios agonistas sigma-1 con interés clínico. A diferencia del PRE-084, el cual es un agonista sigma-1 estándar sin utilidad clínica, el dextrometorfano es un agonista sigma-1 clásico con un uso amplísimo como antitusígeno, y la pridopidina es un agonista selectivo sigma-1 que está actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (Naia et al., 2021). La administración subcutánea de cualquiera de estos tres productos no produjo ninguna alteración en la respuesta frente a un estímulo mecánico (test de presión plantar) en el ratón, mientras que cuando se administraron a animales inyectados intraplantarmente con una dosis aparentemente ineficaz de PGE2, indujeron una hiperalgesia mecánica robusta. Puesto que la PGE2 es un mediador inflamatorio, exploramos el efecto de los agonistas sigma-1 en una situación que conlleva una inflamación real: un daño tisular inducido por una incisión plantar. A las pocas horas de la incisión (3,5 h) los animales mostraron una disminución aparente del peso apoyado en la pata dañada, valorado mediante el test de distribución de carga dinámica (en inglés ¿Dynamic Weight Bearing distribution¿). Sin embargo, a las 24 horas del daño quirúrgico, los animales mostraron una recuperación total en este parámetro, pese a presentar un edema notable con una infiltración neutrofílica marcada en el sitio de la incisión. En esta situación, los agonistas sigma-1 indujeron una recaída clara de la pérdida de apoyo en la pata operada. Se sabe que los neutrófilos son una de las fuentes principales de PGE2, y de hecho, el efecto proalgésico de los agonistas sigma-1 tras la incisión plantar fue revertido por la administración de un anticuerpo frente al LY6G, el cual inhibió selectivamente el reclutamiento de neutrófilos en la herida quirúrgica. Estos resultados indican que el efecto pronociceptivo periférico del agonismo sigma-1 depende de la presencia de neutrófilos. Los efectos de los agonistas sigma-1, tanto en la hiperalgesia inducida por PGE2 como en la incisión plantar, se revirtieron mediante la administración del antagonista sigma-1 BD-1063 en ratones de genotipo salvaje (WT, de sus siglas en inglés ¿Wild-Type¿). Además, los agonistas sigma-1 no produjeron su efecto proalgésico en animales mutantes desprovistos del receptor sigma-1 (KO, de sus siglas en inglés ¿knockout¿). Ambos resultados respaldan la selectividad de los efectos observados. En cuanto a la población de neuronas sensoriales involucrada en los efectos pronociceptivos de los agonistas sigma-1 en el ratón, encontramos que estos efectos dependen de la acción de los nociceptores TRPV1+, ya que la administración de RTX revirtió completamente el efecto de estos fármacos. Hasta el momento, solo habíamos demostrado el marcaje del receptor sigma-1 en el DRG del ratón, por lo que también estudiamos la distribución de este receptor en muestras humanas de DRG. Encontramos resultados virtualmente idénticos en ambas especies, con la presencia del receptor sigma-1 en todas las neuronas sensoriales periféricas, por lo que nuestros hallazgos en animales de experimentación podrían tener una repercusión clínica relevante. En resumen, estos resultados muestran que el receptor sigma-1 está presente en las neuronas del DRG tanto de humanos como de ratón, y que el agonismo de este receptor exacerba el dolor en ratones con una afección inflamatoria. El mecanismo de las acciones pronociceptivas del agonismo sigma-1 implica la potenciación de las acciones de los algógenos químicos liberados por las células inmunitarias, como por ejemplo de la PGE2, los cuales son capaces de sensibilizar a los nociceptores TRPV1+. La interacción entre el sistema inmunitario y las neuronas sensoriales no es unidireccional. De hecho, se sabe que las neuronas sensoriales participan en el reclutamiento inmunitario tanto a nivel periférico (DRG) como central (médula espinal dorsal), en varias circunstancias de dolor crónico, como puede ser el dolor neuropático. Esto produce un proceso neuroinflamatorio de suma importancia en el desarrollo y mantenimiento del dolor (Austin et al., 2010). De hecho, se ha demostrado repetidamente, mediante el análisis del transcriptoma del DRG o de la médula espinal dorsal, que la mayoría de los cambios en la expresión génica que ocurren durante el dolor neuropático tras la lesión de un nervio corresponden al proceso de neuroinflamación. Se sabe que el receptor sigma-1 puede participar en la neuroinflamación tras una lesión nerviosa (e.g. Bravo-Caparrós et al., 2020), aunque su papel en este proceso no se ha estudiado de manera exhaustiva. Por lo tanto, nuestro siguiente objetivo fue evaluar, mediante secuenciación masiva del ARN (ARNseq), los cambios transcripcionales inducidos por una misma lesión nerviosa tanto a nivel periférico como en la médula espinal. Para alcanzarlo, hemos evaluado el efecto de la inhibición del receptor sigma-1 (en ratones KO para este receptor) en el trascriptoma del DRG y de la médula espinal dorsal, tras la sección parcial del nervio ciático en el modelo de SNI (de sus siglas en inglés ¿Spared Nerve Injury¿). El SNI indujo una alodinia mecánica (evaluada con el test de von Frey) y al frío (evaluada mediante el test de la acetona) muy robusta. Ambas estuvieron atenuadas en ratones KO sigma-1. Los cambios transcripcionales fueron analizados mediante la secuenciación masiva del ARN (ARN-seq). A nivel del DRG, el SNI indujo alteraciones principalmente en la expresión de tránscritos inmunitarios, incluyendo una amplia variedad de citoquinas y marcadores de células inmunitarias, tales como macrófagos/monocitos y células T, particularmente CD4+. Parte de estos transcritos inmunitarios estaban atenuados en los ratones KO sigma-1. Demostramos, mediante citometría de flujo, que efectivamente estos ratones mutantes tienen una disminución en el reclutamiento de macrófagos/monocitos y, curiosamente, una eliminación total del reclutamiento de células T CD4+ en el DRG tras la lesión nerviosa. Sin embargo, los ratones KO sigma-1 mostraron una respuesta neuroinflamatoria equivalente a la de los ratones WT en la médula espinal dorsal. Además, estos animales mutantes mostraron un reclutamiento inmunitario normal en la pata tras una inflamación experimental (inducida por la administración intraplantar de adyuvante completo de Freund). Por lo tanto, la disminución de la neuroinflamación periférica que encontramos en los ratones KO sigma-1 no se debe a un déficit general del funcionamiento inmunitario. Por último, el tratamiento con maraviroc, un antagonista periférico del CCR5, que inhibe principalmente a las células T CD4+, tuvo un efecto antialodínico frente al estímulo mecánico aunque no frente al estímulo frio. Por lo tanto, la inhibición inmunitaria por este fármaco no replicó completamente el efecto de la inhibición del receptor sigma-1, que como se ha comentado anteriormente, atenúa ambas formas de hipersensibilidad sensorial. Nuestros datos indican que los receptores sigma-1 desempeñan un papel fundamental en la comunicación entre las neuronas sensoriales periféricas y el sistema inmunitario tras una lesión nerviosa. Sin embargo, aunque la modulación de la neuroinflamación periférica por los receptores sigma-1 podría explicar la mejoría de la alodinia táctil neuropática observada en ratones KO, difícilmente puede explicar el efecto en la alodinia al frío. Por lo tanto, la inhibición del receptor sigma-1 puede ser potencialmente eficaz para disminuir el dolor neuropático a través de la inhibición de la neuroinflamación periférica y de mecanismos adicionales. Teniendo en cuenta todo lo comentado anteriormente, las conclusiones globales de esta Tesis Doctoral son las siguientes: 1. Los receptores sigma-1 periféricos son moduladores importantes de la sensibilización de los nociceptores TRPV1+ actuando directamente en el lugar de la lesión dolorosa: mientras que los antagonistas sigma-1 potencian la acción de los opioides endógenos neuronales, reduciendo la hiperalgesia inducida por mediadores inflamatorios, el agonismo sigma-1 tiene un efecto contrario, maximizando la sensibilización periférica inducida por algógenos químicos producidos por las células inmunitarias. 2. Los receptores sigma-1 también son importantes en la interacción entre las neuronas sensoriales periféricas y las células inmunitarias durante el dolor neuropático. La inhibición de los receptores sigma-1 reduce el dolor neuropático, al menos en parte, por la disminución de la respuesta neuroinflamatoria que se produce en el DRG tras una lesión nerviosa. 3. Los antagonistas sigma-1 tienen un potencial analgésico claro en varias circunstancias dolorosas, mientras que el agonismo sigma-1 muestra efectos pronociceptivos que podrían, al menos potencialmente, constituir un efecto secundario en pacientes tratados con agonistas sigma-1. Bibliografía Austin, P. J. & Moalem-Taylor, G. (2010). The neuro-immune balance in neuropathic pain: involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines. J. Neuroimmunol. 229, 26-50. Bravo-Caparrós, I., Ruiz-Cantero, M. C., Perazzoli, G., Cronin, S. J. F., Vela, J. M., Hamed, M. F., Penninger, J. M., Baeyens, J. M., Cobos, E. J., & Nieto, F. R. (2020). Sigma-1 receptors control neuropathic pain and macrophage infiltration into the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. FASEB J. 34, 5951-5966. Bruna, J., Videla, S., Argyriou, A. A., Velasco, R., Villoria, J., Santos, C., Nadal, C., Cavaletti, G., Alberti, P., Briani, C., Kalofonos, H. 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