Resurrected ancestral proteins as scaffolds for enzyme engineering and evolution

Resumen

Las enzimas son máquinas moleculares naturales extraordinariamente eficientes que catalizan las reacciones y transformaciones químicas que sustentan la vida de todos los organismos. Décadas de investigación intensiva han logrado avances significativos en el estudio de las enzimas. Los investigadores han desarrollado metodologías y aproximaciones sofisticadas para estudiar de manera extensiva y conseguir un conocimiento en profundidad sobre sobre las bases moleculares de la estructura, dinámica, función y regulación de las enzimas. Como resultado, hoy en día es posible describir de forma precisa las implicaciones fisicoquímicas de cada elemento involucrado en el sitio activo de prácticamente cualquier enzima durante los procesos moleculares específicos que permiten las reacciones catalíticas. Además, el conocimiento extensivo sobre la catálisis enzimática nos ha permitido entender cómo las enzimas han evolucionado durante miles de millones de años de selección natural para catalizar reacciones químicas con eficiencia, especificidad y selectividad excelentes con respecto a las reacciones de transformación y sus sustratos. En general, el estudio de las enzimas ha abierto una fascinante ventana a la maquinaria molecular de la vida. Pero, además, ha permitido a los investigadores acumular una sólida base de conocimiento científico que podemos aplicar en el diseño, modificación y optimización de la arquitectura molecular de las enzimas con el objetivo de diseñar versiones artificiales y modificadas de enzimas a medida para catalizar reacciones químicas de interés biotecnológico y biomédico. A pesar del extenso y avanzado conocimiento sobre los fundamentos y la evolución de la catálisis enzimática, sigue habiendo una pregunta elemental sin respuesta con respecto al estudio de las enzimas: ¿Cómo emergió y evolucionó la catálisis enzimática por primera vez durante el origen de las proteínas y las enzimas? La capacidad de entender los mecanismos moleculares que subyacen a la emergencia evolutiva de nuevas capacidades catalíticas en enzimas no solo es fundamental para entender el nacimiento de las enzimas y sus implicaciones en el origen de la vida. Además, es crítica para diseñar nuevas aproximaciones biotecnológicas inspiradas en estos mecanismos moleculares con el objetivo de diseñar y generar de forma eficiente nuevas enzimas para catalizar reacciones químicas artificiales no naturales de interés. Sin embargo, el estudio basado en enzimas modernas, encontradas en los organismos actuales, con el objetivo de responder a esta pregunta fundamental no logrado avances significativos. En esta tesis proponemos la hipótesis de que las proteínas ancestrales resucitadas podrían funcionar como mejores “andamios moleculares”, en comparación con sus homologas modernas, para estudiar y comprender la emergencia de la catálisis enzimática. El estudio de sitios activos ancestrales y sus arquitecturas moleculares podría ser más útil para revelar y estudiar los requerimientos mínimos necesarios para la catálisis enzimática. Además, las proteínas ancestrales podrían ser mejores puntos de inicio para el diseño de sitios nuevos sitios activos para catalizar reacciones químicas no naturales artificiales. En este sentido, lograr avances en ambas direcciones tendría importantes implicaciones para entender y revelar los procesos moleculares que dirigen la emergencia de nuevas catálisis enzimáticas en la naturaleza. Por lo tanto, las proteínas ancestrales muestran de potencial de tener un profundo impacto en nuestra comprensión sobre la catálisis enzimática, con implicaciones críticas en nuestro conocimiento sobre el origen de la vida y la capacidad de desarrollar nuevas enzimas artificiales. Para validar nuestra hipótesis, hemos realizado diferentes experimentos con diferentes sistemas de proteínas ancestrales resucitadas con el objetivo de evolucionar un sitio activo artificial de novo y de entender cómo niveles primordiales de catálisis dependiente de un cofactor son mejorados en un andamio molecular ancestral sin evolucionar. En la primera parte de la tesis describimos la evolución de un sitio activo artificial de novo, previamente diseñado en el andamio molecular de una β-lactamasa ancestral mediante cribados computacionales y experimentales de bajo número. Como resultado, hemos demostrado cómo mutaciones en residuos directamente involucrados en el sitio activo artificial o cómo la introducción de nuevos residuos adicionales en la secuencia de la proteína puede mejorar la preorganización geométrica del sitio activo y generar nuevas interacciones que aumentan la estabilización del estado de transición y mejoran los bajos niveles de actividad enzimática para llegar a una catálisis enzimática eficiente comparable a la de enzimas naturales. Estos resultados tienen implicaciones inmediatas en ingeniería de proteínas y el diseño de novo de enzimas. Pero, adicionalmente, aporta nuevo conocimiento sobre los mecanismos evolutivos que pudieron dar lugar a la optimización temprana de sitios activos nuevos durante la emergencia de la catálisis enzimática. En la segunda parte de esta tesis, hemos resucitado una glicosidasa ancestral que presenta un plegamiento típico en forma de barril TIM y que muestra unas propiedades bioquímicas y biofísicas inusuales. Principalmente, nuestro barril TIM ancestral muestra la capacidad de unir una molécula del cofactor redox hemo en una región excepcionalmente flexible de arquitectura del barril. La unión del hemo da lugar a un aumento general de la rigidez de la estructura de la proteína, a una modulación alostérica de la actividad natural de la enzima y a la generación de una actividad peroxidasa nueva no natural basada en el poder catalítico redox intrínseco del hemo. Como resultado, nuestra proteína ancestral con estructura de barril TIM y con la capacidad de unir hemo demuestra el potencial de la resurrección ancestral de proteínas como andamios que muestran combinaciones inusuales de propiedades con interés biotecnológico. Adicionalmente, el estudio de nuestro barril TIM con actividad redox aporta nuevos puntos de vista sobre el papel de la protección de los cofactores durante la emergencia de las proteínas y la catálisis enzimática durante en origen de la vida. En general, los resultados presentados en esta tesis apoyan la hipótesis de que las proteínas ancestrales resucitadas pueden servir como mejores andamiajes moleculares en la ingeniería y estudios evolutivos de enzimas, dirigidos a lograr un mayor conocimiento sobre la emergencia de la catálisis enzimática durante el origen de la vida.