El efecto dual de SIRT1 en el cáncer colorrectal depende del estado de p53.Nuevos tratamientos basados en análogos de la melatonina

Resumen

El cáncer colorrectal (CCR) a nivel mundial es el tercer tipo en cuanto a diagnóstico y causa de muerte por cáncer. A pesar de la gran cantidad de avances que se están produciendo en cuanto a prevención, diagnóstico y tratamiento, continúa presentando una alta recidiva y una baja supervivencia. Por ello, es necesaria la descripción de nuevos biomarcadores y el desarrollo de nuevos tratamientos. El CCR se caracteriza por una gran heterogeneidad celular, debido, en parte, a la presencia de células madre cancerígenas (CMCs). Esta subpoblación de células se considera responsable del inicio del cáncer, pero además se ha relacionado con el proceso de recidiva, metástasis, capacidad de autorrenovación o desarrollo de resistencia a los tratamientos. Por ello, este tipo celular se está utilizando como diana terapéutica. Uno de los tratamientos utilizados como primera línea terapéutica frente al CCR es el 5-Fluorouracilo (5-FU). Una gran cantidad de pacientes desarrollan resistencias frente a él, además de los graves efectos secundarios derivados de su uso. Por esta razón, uno de los principales objetivos en el campo de investigación del CCR es el desarrollo de nuevos fármacos o el uso combinado de los ya existentes, con el fin de aumentar la sensibilidad celular, disminuir los efectos secundarios y aumentar la supervivencia de los pacientes. A pesar de la mejora observada tras el uso combinado de estos tratamientos, gran parte de los pacientes no se están beneficiando de dicha terapia. Este efecto podría estar relacionado con el estado del represor tumoral p53, el cual se encuentra mutado o sin actividad en más del 50% de los pacientes con CCR, y cuya funcionalidad es fundamental para la eficacia del 5-FU. Por esta razón, apremia la necesidad de encontrar estrategias de tratamiento más efectivas frente a este tipo tumoral teniendo en cuenta no solo las características tumorales sino también las del propio paciente, aplicando la medicina personalizada. Hace tiempo que se conoce la implicación de Sirt1 en la resistencia al tratamiento con 5-FU. Dada la gran cantidad de funciones que desempeña esta enzima desacetilasa de clase III en el proceso de tumorogénesis y su implicación con el represor tumoral p53, se propuso identificar la causa de la dualidad descrita para Sirt1 en el proceso de desarrollo tumoral, lo que además permitiría su uso como un nuevo biomarcador. El principal objetivo de este trabajo fue evaluar el papel que presenta Sirt1 en cuanto al desarrollo tumoral en CCR teniendo en cuenta el estado del represor tumoral p53 como posible vía de acción. Con el fin de desarrollar estos objetivos se comprobó el nivel de expresión de Sirt1 en muestras tumorales de pacientes con CCR, los cuales se organizaron en función del estado de p53. Viendo que el incremento en la expresión de Sirt1 era dependiente del estado del represor tumoral, solamente se producía cuando este se encontraba en estado salvaje. En estos mismos pacientes se observó una elevada expresión de marcadores de CMCs, lo que explicaría el papel dual de Sirt1 en el CCR descrito en la bibliografía. Dada la importante relación entre SIRT1 y los ritmos circadianos, se analizó la posible correlación entre los genes del reloj principal y la expresión de SIRT1 en estas mismas muestras de pacientes. Se observó una correlación entre la expresión de Per1 y Per3 con la expresión de SIRT1 en los tumores que presentaban p53 en estado salvaje y mutado, respectivamente en los casos con marcadores de CMCs elevados, indicando una posible relación entre ellos. Para corroborar estos resultados, se realizaron estudios in vitro, se utilizaron 2 líneas celulares estables de CCR con diferente estado de p53, en las que se silenció de manera estable Sirt1. Después estudiar factores como la proliferación, viabilidad, apoptosis celular y fenotipificación de CMCs, se observó que el silenciamiento de Sirt1 en células con p53 no funcional, hace que estas se comporten de manera más agresiva, mientras que en la línea celular con p53 salvaje ocurre todo lo contrario. Dada la relación entre Sirt1 y la regulación de los ritmos circadianos, se comprobó si el silenciamiento de este influía en la ritmicidad de estos genes, en función de su estado y del de p53. Se observaron cambios en los parámetros de ritmicidad en todos los genes estudiados (Clock, Per2y Prx1). Las modificaciones fueron diferentes para cada uno de ellos y dependientes del estado de p53, excepto en el caso de Clock donde el silenciamiento de Sirt1 indujo un adelanto de la acrofase en ambas líneas. Estos resultados demuestran que el papel dual descrito para Sirt1 en el CCR podría deberse a su comportamiento según el estado de p53. Además, actúa a través de la regulación de los ritmos circadianos. Debido a que Sirt1 se encuentra implicado en la regulación de los ritmos circadianos, muy relacionados con el proceso de homeostasis celular y desarrollo tumoral, se planteó el uso de reguladores de su expresión como posibles tratamientos para el CCR. Un conocido regulador de Sirt1 es la melatonina, una indolamina relacionada con la regulación de los ritmos circadianos a nivel central. Puesto que se ha descrito que esta propiedad la lleva a cabo a través de sus receptores de membrana, nos planteamos la posibilidad de usar un agonista de la melatonina como posible tratamiento para este tipo de cáncer. La comprobación del efecto de la melatonina se realizó tanto en modelos in vivo como in vitro. La melatonina indujo la inhibición del crecimiento celular en los dos modelos utilizados, dio lugar a parada del ciclo celular e incrementó la apoptosis. Aunque estos efectos únicamente fueron significativos cuando p53 se encontraba en estado salvaje. Teniendo en cuenta las limitaciones observadas a partir del tratamiento con melatonina, se estudió el efecto tras el tratamiento con agomelatina. Este compuesto es un agonista de los receptores de la melatonina MT1 y MT2, y un antagonista del receptor de la serotonina HT2C, que presenta una mayor afinidad frente a estos receptores. Actualmente se utiliza como tratamiento frente a la depresión y otros trastornos neurológicos, a través de la resincronización de los ritmos circadianos. Por ello, se planteó utilizar dicho tratamiento en el CCR dada la importancia de estos procesos en el desarrollo tumoral. Este tratamiento inhibió el crecimiento celular en los modelos in vivo e in vitro utilizados. También indujo parada del ciclo y apoptosis dependiente de caspasas. El efecto de la agomelatina observado fue independiente del estado de p53, aunque el efecto sobre la reducción del crecimiento celular fue más eficaz en presencia de p53 en estado salvaje, al menos en el modelo in vitro. Tanto la melatonina como la agomelatina fueron capaces de resincronizar los ritmos de Per1, Per2, Per3, Cry1 y Clock en células que presentaban p53 en estado salvaje, aunque los cambios producidos en los parámetros de ritmicidad estudiados fueron más bruscos en el caso del tratamiento con agomelatina. Por su parte en ausencia de p53 el número de genes regulados por ambos fármacos fue menor que lo observado en la otra línea celular. Estos resultados corroboran la influencia que presenta el reloj circadiano sobre el efecto antiproliferativo observado tras el uso de estos tratamientos. También se analizó el efecto de dichas terapias sobre las CMCs, ya que se ha descrito que esta subpoblación presenta un ritmo circadiano muy robusto. El tratamiento con melatonina indujo un cambio fenotípico de estas células hacia otro menos agresivo únicamente en aquellas que presentaban p53 en estado salvaje. Por su parte la agomelatina incrementó en las células con p53 sin actividad, la capacidad de renovación, la actividad aldefluor deshidrogenasa y el porcentaje de células con una alta expresión de marcadores de CMCs Ambos tratamientos redujeron su efectividad en cuanto a la disminución de la viabilidad cuando Sirt1 no se encontraba presente. En cuanto a la distribución de las células en el ciclo celular, se observó un efecto contrario en función del estado de p53. En las células con p53 activo se produjo un incremento de células fase G0/G1, mientras que sin p53 se produjo un incremento de la fase S. Al analizar los efectos en el modelo in vivo¸ se comprobó como el efecto citotóxico de la melatonina si era dependiente de Sirt1, lo que únicamente se producía en aquellas células que presentaban p53 en estado salvaje. Sin embargo, el tratamiento con agomelatina no indujo ningún efecto dependiente del estado de Sirt1 y/o p53. La inducción de la autofagia por parte de la agomelatina fue dependiente del estado de Sirt1. De manera general, el tratamiento con agomelatina sobre células que presenten p53 nulo y Sirt1 silenciado presenta una peor efectividad, ya que se incrementan las características de CMCs y estas presentan una mayor agresividad. Por último, al estudiar el efecto de los tratamientos sobre la regulación de los ritmos en función del estado de p53 y de Sirt1, se observó que las modificaciones producidas fueron diferentes. El tratamiento con agomelatina modificó al menos uno de los parámetros estudiados en todos los casos, excepto en ausencia de p53 en el gen Clock. Mientras que la melatonina únicamente indujo cambios la ritmicidad de Clock en presencia de p53, y en Per2 y Prx1 cuando p53 no se encontraba presente.