Diseño, generación y evaluación preclínica de sustitutos biomiméticos de cartílago hialino basados en la combinación de microtejidos, células madre mesenquimales y biomateriales

Abstract

INTRODUCCIÓN: Diversas patologías pueden afectar a los tejidos cartilaginosos y, en particular las que afectan al tejido hialino, presentan una alta prevalencia en la población [1]. Los tratamientos actuales no han conseguido restablecer la funcionalidad de dichos tejidos a largo plazo, por lo que el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas sigue estando vigente [2]. En este contexto, surge la Ingeniería Tisular (IT), que tiene como objetivos la reparación, restauración o mejora de los tejidos y/o órganos dañados o perdidos mediante la combinación de 3 pilares básicos en los que se sustenta: las células, los biomateriales y las biomoléculas [3]. En la actualidad, una parte importante de los esfuerzos dentro de la IT se centran en, dentro de estos pilares básicos, encontrar diferentes alternativas que permitan mejorar las características funcionales y el éxito de los posibles tejidos artificiales generados. Respecto al apartado celular de la IT de cartílago, el empleo de fuentes celulares tradicionales como los condrocitos hialinos humanos (CHH) puede acarrear ciertas limitaciones, como una reducida tasa de proliferación o posibles procesos de desdiferenciación asociados al cultivo celular [4, 5]. Fuentes celulares alternativas como los condrocitos derivados de cartílago elástico humano (CEH) o las células madre mesenquimales pueden solventar los problemas de proliferación celular a la vez que exhiben una considerable capacidad condrogénica, convirtiéndose en prometedoras fuentes celulares para la IT del cartílago [6, 7]. Para reducir los procesos de desdiferenciación y preservar las funciones celulares, diversas metodologías han sido desarrolladas en los últimos años. Una de ellas es la técnica de generación de microtejidos (MT) mediante microchips de agarosa [8, 9]. Esta técnica permite, mediante el control de las condiciones de cultivo, la generación de estructuras tridimensionales funcionales en las que es posible promover las interacciones célula-célula y la síntesis de componentes de matriz extracelular (MEC). De esta manera es posible conformar estructuras tridimensionales altamente biomiméticas compuestas exclusivamente por células y la MEC generada por ellas mismas [8, 9]. La presente Tesis Doctoral aspira a generar ex vivo nuevas estructuras cartilaginosas basadas en MTs derivados de fuentes celulares condrogénicas, como los condrocitos hialinos (CHH) y elásticos (CEH) [comparando además el posible efecto diferencial en los mismos de condiciones de cultivo de expansión (ME) o condrogénicas (MC)] y de fuentes celulares mesenquimales como las derivadas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical (WJSC). Además, se pretende caracterizar el comportamiento de los MTs condrogénicos al ser combinados con biomateriales de fibrina-agarosa (FA) a fin de determinar el perfil de viabilidad, capacidad de migración y síntesis de componentes de la MEC. El análisis de estos resultados puede ser clave para el diseño de futuros estudios in vivo que prueben la eficacia terapéutica de estos sustitutos y su posible aplicación en protocolos de IT de cartílago u otros tejidos. MATERIALES Y MÉTODOS: Los estudios realizados en la presente Tesis Doctoral generaron MTs ex vivo mediante la técnica de los microchips de agarosa. Para ello, se emplearon moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) para generar réplicas de agarosa tipo I con un patrón predefinido de micropocillos. Sobre dichos pocillos se sembraron las células, definiéndose 5 grupos de estudio en función del origen celular (CHH, CEH o WJSC). Además, en el caso de los MTs derivados de condrocítos, dos medios de cultivo fueron empleados durante su desarrollo (ME o MC). Posteriormente, las propiedades morfoestructurales, biológicas e histológicas de dichos MTs fueron evaluadas durante 28 días de desarrollo ex vivo (DEV). Además, se realizó un análisis ex vivo del comportamiento de los CHH-MT mantenidos en MC al ser combinados con un hidrogel compuesto de fibrina-agarosa (FA). Estos cultivos fueron evaluados tras 7, 14 y 28 días de DEV en términos de viabilidad y función celular. Adicionalmente, mediante análisis histológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos, se analizó el patrón de distribución celular y la síntesis de moléculas de la MEC en dichos hidrogeles. RESULTADOS: Los CHH y CEH demostraron generar MTs viables durante el periodo evaluado. Sin embargo, los resultados obtenidos revelaron un comportamiento diferencial entre los MTs derivados de condrocitos en función del medio de cultivo empleado y el tipo celular. Atendiendo al medio de cultivo, las condiciones condrogénicas mejoraron la estabilidad estructural y la compactación progresiva de los MTs en ambos tipos celulares a la vez que estabiliza el metabolismo y promueve la síntesis de proteoglucanos y colágeno tipo II. Por otra parte, los CHH-MTs mostraron mayor grado de compactación que los CEH-MTs, en las que fue posible observar signos de desagregación celular en tiempos tardíos al ser cultivados bajo ME. Sin embargo, los CEH-MTs presentaron mayores índices metabólicos y síntesis de colágeno tipo IV que los CHH-MTs (resultados en detalle [10]). Los análisis respectivos a los WJSC-MTs demostraron la capacidad de las WJSC de sintetizar los principales componentes de las membranas basales tanto in situ en el cordón umbilical como al ser empleadas en la generación de MTs, siendo esta última notablemente superior en comparación a cultivos celulares tradicionales en dos dimensiones. Además, los análisis ultraestructurales demostraron la deposición de estos componentes tanto en el núcleo de los MTs como de manera pericelular en un patrón similar a una lámina basal (resultados en detalle [11]). Por último, los ensayos de encapsulación de los MTs en hidrogeles de FA pusieron de relieve la biointegración temporal de ambos componentes al demostrarse la presencia de células viables y metabólicamente activas sin que se produjera una interrupción en el programa de síntesis de los distintos elementos de la MEC por parte de los MTs. CONCLUSIONES: Los resultados obtenidos demostraron la posibilidad de generar ex vivo MTs derivados de condrocitos estables, viables y con gran capacidad de síntesis de componentes de MEC específicos durante el periodo evaluado, especialmente al ser desarrollados bajo condiciones condrogénicas. Además, también se demostró la capacidad aumentada de las WJSC de sintetizar los principales componentes de membrana basal al conformar MTs y la formación de estructuras tipo lamina basal con potencial aplicación en la regeneración de tejidos que presentan estos componentes, como el tejido cartilaginoso o el nervioso. No obstante, la potencialidad terapéutica de los MTs y sustitutos artificiales generados durante la presente Tesis Doctoral debe ser evaluada en estudios futuros. PALABRAS CLAVE: Microtejidos, condrocitos hialinos, condrocitos elásticos, células madre mesenquimales, Ingeniería Tisular Bibliografía 1. Blanco FJ, Silva-Diaz M, Quevedo Vila V, Seoane-Mato D, Perez Ruiz F, Juan-Mas A, Pego-Reigosa JM, Narvaez J, Quilis N, Cortes R, Romero Perez A, Fabregas Canales D, Font Gaya T, Bordoy Ferrer C, Sanchez-Piedra C, Diaz-Gonzalez F, Bustabad-Reyes S, en representacion del Grupo de Trabajo del Proyecto E. Prevalence of symptomatic osteoarthritis in Spain: EPISER2016 study. 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