Desarrollo de metodologías analíticas para el análisis de disruptores endocrinos obesógenos en matrices biológicas

Abstract

En la presente memoria se recopilan los resultados obtenidos en el desarrollo de la Tesis Doctoral que tiene por nombre `Desarrollo de metodologías analíticas para el análisis de disruptores endocrinos obesógenos en matrices biológicas¿. Para lograr los objetivos planteados, se han estudiado diversos biomarcadores del cuerpo humano: saliva, orina, heces y uña, con el fin de determinar la presencia y/o frecuencia de dos familias de compuestos con actividad obesógena presentes de forma ubicua en el medioambiente: los parabenos y los bisfenoles. La memoria se divide en dos grandes bloques: el Bloque 1 contextualiza el estudio mediante un texto introductorio, mientras que el Bloque 2 se centra en los resultados y discusión. En el Bloque 1 de Introducción se describe el contexto de la obesidad y la problemática que supone actualmente. Para profundizar, se habla del papel del tejido adiposo en el organismo, de su función como glándula endocrina y del mecanismo de actuación cuando existe una respuesta hormonal. Además, se pone en contexto el papel que un grupo de compuestos químicos, los disruptores endocrinos químicos, EDCs, tiene en el desarrollo de esta patología. Este subapartado versa sobre el descubrimiento de estos contaminantes, se realiza una clasificación de ellos y se explica el funcionamiento como sustitutos de las hormonas. Así mismo, se hace mención especial a los obesógenos, presentando a las dos familias de compuestos que se estudian en este trabajo: los parabenos y bisfenoles. A continuación, se detallan aspectos de los biomarcadores a utilizar, previamente mencionados, explicando el porqué de su elección. En una segunda parte del apartado de Introducción, se desarrollan las estrategias utilizadas en la presente Tesis Doctoral para la cuantificación de estos obesógenos en las distintas matrices, entre las que destacan las técnicas de separación y detección (con cromatografía de líquidos y de gases acopladas a espectrometría de masas), el tratamiento de muestra (tanto pretratamiento como diversas técnicas de extracción), y el tratamiento estadístico de los datos, englobando el diseño de experimentos y la validación utilizada. Para finalizar, se introduce al lector en los estudios epidemiológicos, explicando la importancia de estos, el reclutamiento de muestra y el tratamiento estadístico utilizado. El Bloque 2, centrado en el desarrollo experimental de la presente Tesis Doctoral, consta de dos secciones diferenciadas: en la Sección 1 se engloban los artículos científicos relacionados con el desarrollo, validación y aplicación de diversos métodos analíticos mediante cromatografía de líquidos o de gases, que a su vez, consta de 3 capítulos distintos: -El Capítulo 1 estudia la saliva humana como biomarcador para determinar parabenos y bisfenoles mediante cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución (UHPLC) acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Para ello, se evaluaron las diferentes variables que influían en la extracción, como la técnica de extracción comparando digestión asistida por ultrasonidos y digestión asistida por microondas-, tipo y volumen de disolvente, acidez o basicidad del medio y ciclos de extracción. Posteriormente, se sometió a una validación del método propuesto y se aplicó en salivas de 10 niños/as. -El Capítulo 2 describe la mejora de un método analítico existente para determinar EDCs en orina humana mediante UHPLC-MS/MS. En dicho capítulo, se evaluaron tanto la influencia de dos enzimas diferentes como la mejora analítica al aumentar el número de ciclos de extracción. Tras establecer dicha mejora, se validó el método y se aplicó a 30 muestras de una población infantil de entre 6 y 12 años. -En el Capítulo 3 se detallan dos metodologías distintas utilizando las heces como biomarcador. En la primera de ellas, se pone a punto un método de extracción para determinar parabenos mediante UHPLC-MS/MS. Para ello, se compararon dos métodos de extracción, digestión asistida por ultrasonidos y digestión asistida por microondas, estudiando diversos parámetros mediante técnicas univariantes y multivariantes. Además, se evaluó la limpieza del extracto mediante la técnica QuEChERS. Tras ello, se realizó la validación analítica y se sometió a 14 muestras de una población infantil. En la segunda metodología descrita, se desarrolla un nuevo método analítico mediante GC-MS/MS para cuantificar de forma conjunta parabenos y bisfenoles en este biomarcador. Con este fin, se evaluaron las variables críticas tanto para su extracción como para la etapa de clean-up. Además, se estudió la influencia de la adición enzimática. Seguidamente, se validó el método propuesto y se aplicó a un total de 10 heces de niños/as. Por otro lado, en la Sección 2 se desarrolla el estudio epidemiológico de una muestra de población infantil. Es en esta sección donde se encuentra el Capítulo 4, en el cual se relaciona el contenido de parabenos en orina, saliva y uña con el índice de masa corporal (IMC) de la población anteriormente mencionada. Para ello, se utilizaron diversos test estadísticos con el objetivo de clasificar las variables dependientes e independientes, y se evaluó la correlación mediante regresión logística binaria.