In-use stability of the therapeutic monoclonal antibodies Tocilizumab, Nivolumab and PembrolizumabComprehensive analysis of physicochemical parameters and functionality

Resumen

En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado, puesto a punto y validado estrategias analíticas comprensivas para evaluar distintos atributos críticos de la calidad de anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) comerciales. Con la finalidad de alcanzar los objetivos propuestos, estas estrategias se han empleado posteriormente en estudios de caracterización (fisicoquímica y funcional) y estabilidad de los mismas en condiciones de uso hospitalario, los cuales se recogen en los distintos capítulos que conforman esta Tesis Doctoral. Los principales mAbs estudiados han sido tocilizumab, nivolumab y pembrolizumab, aunque también se ha realizado un estudio que recoge una amplia selección de mAbs terapéuticos. Los trabajos recogidos en esta Tesis Doctoral se pueden dividir en tres grandes secciones. La primera sección recoge dos trabajos relacionados con mAbs empleados en el tratamiento de la COVID-19. Esto se debe a que el inicio de esta Tesis coincidió con el inicio de la pandemia causada por el coronavirus SARS-CoV-2, en octubre de 2019. En el primer capítulo se presenta un trabajo de revisión bibliográfica de los mAbs empleados en el tratamiento de la COVID- 19, en el que se ha hecho una diferenciación entre los mAbs no específicos y específicos del SARS-CoV-2. El primer grupo recoge aquellos mAbs que bloquean la acción de la interleucina-6 (IL-6), la cual provoca una respuesta inmune exagerada en los pacientes con dicha enfermedad, por lo que estos mAbs van dirigidos a bloquear un punto clave de la respuesta del sistema inmune de los pacientes infectados. En cambio, el segundo grupo contempla aquellos mAbs que son capaces de neutralizar directamente la estructura proteica del virus, donde se recogen, además, los mAbs que recibieron una autorización de uso de emergencia. El segundo capítulo recoge un trabajo en el que se han estudiado los atributos fisicoquímicos de la calidad de un mAb empleado en el tratamiento de la COVID-19, tocilizumab (RoActemra®, Roche Registration GmbH, Alemania), el cual se trata de un inhibidor de la IL-6. En este estudio se comparan los principales atributos fisicoquímicos de las formas farmacéuticas intravenosa (IV) y subcutánea (SC) de dicho medicamento, con el objetivo de averiguar si la forma farmacéutica SC podía ser administrada de manera IV como consecuencia del desabastecimiento hospitalario de la forma IV. Para ello se utilizaron una amplia variedad de técnicas analíticas: dispersión de luz dinámica (DLS), fluorescencia intrínseca de triptófanos (ITFS), cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de intercambio catiónico (CEX). Estas técnicas permitieron comparar ambas formas medicamentosas a las concentraciones de disolución clínica de 6 y 4 mg/mL de tocilizumab. Además, también se llevaron a cabo estudios de degradación controlada con el objetivo de corroborar la estabilidad de todos los métodos utilizados y para evaluar la comparabilidad de las disoluciones clínicas IV y SC. La segunda sección de esta Tesis está compuesta por tres trabajos llevados a cabo con mAbs inhibidores de puntos de control inmunitario, concretamente estos mAbs tienen la capacidad de bloquear la acción del receptor PD-1. En primer lugar, el tercer capítulo recoge un trabajo realizado con nivolumab (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb Pharma EEIG, Irlanda) en el que se ha desarrollado y validado un método cromatográfico de fase inversa con detección ultravioleta y por espectrometría de masas ((RP)UHPLC/UV- (HESI/Orbitrap™)MS) para la cuantificación del contenido proteico de dicho medicamento. Este se trata de un método indicador de la estabilidad capaz de analizar el fármaco en presencia de sus productos degradados. Tanto el método de detección por absorción en el ultravioleta como el método utilizando espectrometría de masas han sido validados mediante el estudio de determinados parámetros de calidad del método, tales como linealidad, límites de detección y cuantificación, precisión, exactitud, especificidad, robustez y test de la adecuación al sistema (system suitability test). La especificidad del método ha sido evaluada mediante ensayos de degradación forzada en muestas de Opdivo®. Este trabajo también recoge la identificación del perfil de isoformas de nivolumab gracias a la señal obtenida por espectrometría de masas de alta resolución y masa exacta. Además, se realizó un estudio de estabilidad del medicamento durante 15 días para evaluar la aplicabilidad del método. En cuanto al cuarto capítulo, este recoge un análisis comprensivo de las características fisicoquímicas y funcionales de nivolumab (Opdivo®). Para ello, se utilizaron diversas y complementarias técnicas analíticas que aportan información sobre distintos aspectos fisicoquímicos de la proteína, tales como su estructura secundaria y terciaria, el perfil de agregación o el estudio de sus isoformas. Las técnicas utilizadas se pueden agrupar en técnicas espectrofotométricas (dicroísmo circular (CD), IT-FS y DLS), cromatográficas (SEC) y espectrometría de masas. La evaluación de la funcionalidad se llevó a cabo utilizando la técnica ELISA. También se llevaron a cabo estudios de degradación forzada para estudiar en profundidad las propiedades del medicamento, para lo que se sometieron muestras de Opdivo® a distintas condiciones estresantes, tales como elevada temperatura, ciclos de congelación/descongelación, agitación, exposición a la luz y exposición a una alta concentración salina. Los métodos fueron desarrollados ad hoc y validados. El último capítulo de esta sección, el capítulo 5, recoge un trabajo de estructura similar al del capítulo 4, en este caso llevado a cabo con pembrolizumab (Keytruda®, Merck Sharp & Dohme B.V., Países Bajos). En él se ha realizado un análisis comprensivo del medicamento mencionado mediante su caracterización fisicoquímica y funcional a través del empleo de distintas técnicas analíticas complementarias. Entre las técnicas utilizadas encontramos CD, IT-FS, DLS, SEC, RP/UHPLC(UV)-MS/MS y ELISA. Estas han permitido el estudio de las estructuras de orden superior de la proteína, la formación de particulado y agregación, el estudio de las isoformas y la determinación de las modificaciones postraduccionales. En este trabajo también se llevaron a cabo estudios de degradación forzada de muestras del medicamento, el cual fue sometido a diversas condiciones estresantes, tales como altas temperaturas, ciclos de congelación/descongelación, exposición a la luz, exposición a agitación fuerte y suave y exposición a una alta concentración salina. Todas las muestras sometidas a estos estreses fueron analizadas mediante la metodología desarrollada ad hoc y validada empleando las técnicas analíticas mencionadas; los resultados fueron siempre comparados con los resultados de la muestra control del medicamento, es decir, una muestra no sometida a ningún tipo de estrés. De esta forma, los trabajos recogidos en los capítulos 4 y 5 evalúan el impacto de la manipulación hospitalaria sobre la estabilidad de los medicamentos Opdivo® y Keytruda®, y ofrecen recomendaciones sobre el correcto manejo de los mismos durante su manipulación. Por último, la tercera sección está formada por el último capítulo de esta Tesis, capítulo 6, el cual recoge un trabajo realizado sobre un total de diez mAbs terapéuticos comerciales diferentes. Este trabajo consistió en la optimización del ensayo ReFOLD, un método isotérmico que permite predecir la estabilidad a largo plazo de medicamentos basados en mAbs mediante un proceso de desnaturalización química con urea. Para ello, se sometieron los distintos mAbs seleccionados (a tres concentraciones diferentes cada uno) a dos concentraciones altas y distintas de urea (6 M y 6.5 M). Los resultados obtenidos fueron comparados con los resultados de ensayos previos realizados con una concentración de urea de 10 M, con el objetivo de mejorar las dificultades encontradas con tan alta concentración de urea, ya que la concentración de 10 M mostró efectos indeseados en varios de los productos farmacéuticos ensayados, tales como la formación de precipitados. Además, también se estudió la capacidad de mantener una clasificación de la estabilidad de los productos farmacéuticos ensayados con las nuevas concentraciones de urea. Como técnica analítica, en este caso, se empleó SEC para estudiar la capacidad de recuperación del estado nativo de la proteína tras ser sometida a las altas concentraciones de urea.