Desarrollo de procesos de producción de proteínas terapéuticasaumento de la productividad especifica en células hek293

Resumen

La presente tesis doctoral está focalizada en la producción de proteínas recombinantes de interés bioterapéutico mediante el cultivo de células de mamífero. En concreto, el trabajo realizado ha consistido en la obtención de células embrionarias de riñon humano (HEK293) productoras de dos proteínas terapéuticas, la citoquina interferón gamma y el anticuerpo monoclonal terapéutico trastuzumab mediante ingeniería genética. El objetivo principal del trabajo ha sido la mejora genética de las líneas celulares obtenidas, con el fin de aumentar la productividad específica de las mismas, y por tanto la productividad volumétrica de estos bioprocesos. Durante el desarrollo del trabajo se han usado diversas aproximaciones con el fin de conseguir este objetivo. En primer lugar, en el capítulo 3 se ha descrito la construcción de las células productoras de las dos moléculas ejemplo, comprobando que expresan los productos de interés y poniendo a punto las diversas técnicas necesarias para su cultivo. Posteriormente, en el capítulo 4 se han evaluado diferentes elementos genéticos que regulan la expresión y la secreción de las proteínas recombinantes (promotores y péptidos señal), determinándose como elementos óptimos el promotor CMV y el péptido señal del interferón alfa-2. Con estos elementos se ha conseguido multiplicar por 5 la producción específica del anticuerpo monoclonal trastuzumab. En el capítulo 5 se ha explorado un elemento genético de gran importancia para la obtención de líneas celulares recombinantes, el marcador de selección basado en genes metabólicos. Estos marcadores son ampliamente usados en la industria de manufactura de bioterapéuticos, con el fin de seleccionar las células más productoras dentro de una población sin necesidad de usar antibióticos para ello. Sin embargo, su aplicación en células HEK293 se ve dificultada por la presencia en las mismas de enzimas endógenas que interfieren con los marcadores comercialmente disponibles. Los resultados obtenidos durante este capítulo han permitido la definición de 2 marcadores de selección, uno basado en la enzima fenilalanina hidroxilasa, aplicable a células HEK293 no modificadas geneticamente y otro basado en la utilización del gen glutamina sintetasa, aplicado a células HEK293 mutantes obtenidas mediante edición genómica con el sistema CRISP/Cas9. El uso de este último marcador, en combinación con un inhibidor, ha permitido una mejora de entre 3 y 5 veces en la producción de interferón gamma y de trastuzumab, en comparación con el marcador clásico de resistencia a puromicina, basado en resistencia a antibióticos. En el capítulo 6 se ha explorado y desarrollado un método para integrar el vector que contiene el gen que codifica para las proteínas de interés en el genoma de la célula HEK293, de forma dirigida, Para ello, se ha construido y caracterizado un sitio genómico de alta transcripción mediante el uso de la proteína verde fluorescente (eGFP), para integrar posteriormente en dicho lugar el constructo de interés usando el sistema CRISPR/Cas9. Los resultados obtenidos en este capítulo demuestran que la técnica ensayada permite la integración dirigida en el punto deseado del ADN genómico de la célula hospedadora, habiéndose logrado duplicar la producción específica de interferón gamma y aumentando la producción de trastuzumab en un 30%. Finalmente, en el capítulo 7 se detalla el estudio de escalado en biorreactor para la producción de interferón gamma como paso previo a una potencial aplicación industrial. Se ha realizado un completo análisis de las condiciones fisiológicas de cultivo en biorreactor, habiendo sido necesario optimizar la concentración de CO2 y el pH con el fin de conseguir un proceso escalable desde el cultivo en matraz agitado hasta el biorreactor y demostrando que las células HEK293 cultivadas en biorreactor necesitan una mínima cantidad de CO2 para conseguir un metabolismo optimo y mantener la productividad específica. El proceso resultante ha sido escalado con éxito usando un reactor preindustrial de un solo uso de 50L. Se puede concluir que, a tenor de los resultados obtenidos y, dada la variedad de modelos ensayados, las técnicas desarrolladas resultan interesantes de cara a una posible aplicación en la producción de diferentes proteínas recombinantes de interés bioterapéutico, sector de gran importancia económica e industrial.