Cloning, expression and purification/immobilisation of CBM–tagged enzymes involved in multienzymatic production of lactic acid

Resumen

Esta tesis responde a la necesidad de reducir los costes operacionales asociados a la producción, purificación e inmovilización de biocatalizadores empleados en bioprocesos. Para desarrollar y validar las diversas estrategias de intensificación de proceso planteadas en el presente trabajo, se han escogido tres biocatalizadores -alcohol deshidrogenasa (ADH), piruvato descarboxilasa (PDC) y lactato deshidrogenasa (LDH)- los cuales forman parte de un sistema biocatalítico propuesto dentro del proyecto europeo BIOCON-CO₂, para sintetizar ácido láctico. En este contexto, para obtener los biocatalizadores de interés de la forma más eficiente posible, se han integrado diversos procedimientos de diferentes campos, incluyendo métodos de clonación de genes y procesos de producción de proteínas recombinantes con la bacteria Gram negatiu Escherichia coli, así como el desarrollo de un proceso de una única etapa de purificación/inmovilización de biocatalizadores, basado en la afinidad de dominios proteicos de unión a carbohidratos hacia soportes celulósicos de bajo coste. En la primera parte de esta tesis, se empleó la cepa de E. coli NEB 10-ß para la expresión de las tres enzimas implicadas en el sistema multienzimático propuesto para la síntesis de ácido láctico con una cola de histidinas fusionada en su extremo N-terminal. El proceso de producción, basado en el sistema de expresión PBAD, demostró ser exitoso no sólo utilizando medios de cultivo complejos, sino también con medios químicamente definidos, suplementados con aminoácidos, siguiendo una estrategia de cultivo en fed-batch de dos etapas. Sin embargo, las tres enzimas de interés se produjeron posteriormente utilizando una cepa auxotrófica derivada de la cepa M15 a escala de reactor de laboratorio mediante cultivos en fed-batch y con un medio de cultivo definido libre de antibióticos. De este modo, la cepa M15δglyA demostró ser una cepa huésped más adecuada y más robusta para la producción en grandes cantidades de las enzimas necesarias, aunque la cepa NEB 10-ß también resultó ser un huésped microbiano factible. La segunda parte de esta tesis se centró en la generación de nuevas variantes de las enzimas que contenían diferentes módulos de unión a carbohidratos fusionados en los respectivos extremos N-terminal, con el objetivo de desarrollar un método de purificación/inmovilización de una única etapa que permita recuperar las enzimas producidas con una alta especificidad y eficiencia, mediante el uso de soportes de inmovilización de celulosa, que no sólo son económicos sino que también permiten evitar la presencia de iones metálicos, presentes habitualmente en muestras procesadas con resinas de afinidad que contienen metales quelatos. Las tres enzimas diana se coexpresaron con éxito con dos CBM diferentes —uno de ellos proveniente de la chilanasa 10A de T. maritima (CBM9) y otro originario de la proteína estructural A del celulosoma de C. Thermocellum (CBM3) — empleando la cepa de E. coli M15δglyA. Las proteínas de fusión resultantes se produjeron con éxito en altas concentraciones en un reactor de laboratorio siguiendo la misma estrategia aplicada para producir las variantes con cola de histidina. Los resultados mostraron que la cepa M15δglyA era capaz de producir con la misma eficiencia las enzimas fusionadas con los CBM como las fusionadas en la cola de histidinas, demostrándose también que los dominios CBM no tienen un impacto negativo significativo en la capacidad catalítica de las enzimas. Finalmente, se desarrolló y caracterizó el proceso de purificación/inmovilización de un solo paso de las enzimas fusionadas con los CBM en soportes celulósicos de bajo coste y de alta selectividad, incluyendo el estudio de la estabilidad en condiciones de almacenamiento de los derivados inmovilizados y la determinación de la capacidad de carga máxima de los soportes.