Fosfatasa alcalina no específica de tejido. Estudio de propiedades funcionales sobre la función de barrera intestinal y en la inflamación

Resumen

1.INTRODUCCIÓN Las fosfatasas alcalinas (APs) son glicoproteínas homodiméricas (EC. 3.1.3.1) ampliamente distribuidas en numerosas especies que catalizan la hidrólisis de grupos fosfato a pH alcalino, liberando fosfato inorgánico y un grupo alcohol. Pueden desfosforilar una amplia variedad de moléculas, como nucleótidos, lipopolisacáridos bacterianos (LPS) o pirofosfato inorgánico (PPi). En los humanos, existen cuatro isoenzimas de AP, incluyendo formas específicas de tejido: la fosfatasa alcalina intestinal (IAP, codificada por el gen ALPI), la placentaria (PLAP, codificada por ALPP), y la germinal (GCAP, codificada por ALPPL2), junto con la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP), codificada por el gen ALPL. TNAP tiene varias isoformas que difieren en la glicosilación y la sensibilidad a inhibidores que reciben el nombre del tejido donde se expresan principalmente: el hígado, el hueso y el riñón (1). TNAP desempeña un papel crucial en la mineralización ósea al hidrolizar el pirofosfato inorgánico, facilitando la mineralización esquelética y dental (2). También está involucrada en la señalización purinérgica, actuando como una ectonucleotidasa para hidrolizar el ATP extracelular a adenosina (3). Investigaciones recientes han resaltado la importancia de TNAP en el metabolismo hepático (4), la termogénesis (5) y el mantenimiento de las células del sistema inmunológico (6,7). La colina, un sustrato de TNAP, podría vincular la actividad de TNAP con el metabolismo hepático (8). Esta isoforma de la fosfatasa alcalina también se expresa en el intestino, específicamente en los leucocitos de la lámina propia y en las células epiteliales intestinales (IECs) (9). Entre las fosfatasas alcalinas, la IAP está bien caracterizada y está involucrada en la absorción de lípidos (10,11), la secreción de bicarbonato (12,13), la atenuación de la inflamación mediada por LPS (14-17) y la desfosforilación de nucleótidos y otras moléculas inflamatorias (18,19). La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la principal manifestación hepática del síndrome metabólico y la enfermedad hepática crónica más frecuente en los países occidentales, con una prevalencia general de aproximadamente el 25% en la población adulta, especialmente en personas con obesidad y diabetes. La NAFLD se caracteriza por esteatosis hepática (acumulación de triglicéridos en los hepatocitos) en presencia de factores de riesgo metabólicos (particularmente obesidad y diabetes tipo 2) y en ausencia de un consumo excesivo de alcohol ( 30g/día para hombres y 20g/día para mujeres) u otras enfermedades hepáticas crónicas (20 -22). Múltiples factores, como la resistencia a la insulina, la microbiota, la genética y factores ambientales, contribuyen a la NAFLD. La función de barrera intestinal también puede desempeñar un papel en la patogénesis de la NAFLD, con un aumento de la permeabilidad bacteriana que podría contribuir al daño hepático y extrahepático (23 -29). Las acciones de TNAP, incluida la desfosforilación de moléculas proinflamatorias y el mantenimiento de la permeabilidad intestinal, pueden afectar a la susceptibilidad a la NAFLD. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) comprende la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, caracterizadas por la inflamación crónica y la disfunción inmunológica. Los pacientes con EII requieren intervenciones médicas y quirúrgicas prolongadas que afectan su calidad de vida. Las causas exactas de la EII aún no están claras, pero involucran un sistema inmunológico de la mucosa intestinal alterado en individuos genéticamente susceptibles. TNAP (30). Se ha observado una inducción de TNAP en intestinos inflamados (31), pero su papel en la EII se comprende de manera limitada. Por lo tanto, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo elucidar el papel de TNAP en la NAFLD y en el epitelio intestinal en condiciones basales e inflamadas. 2.OBJETIVOS El objetivo general de esta tesis doctoral es esclarecer el papel de la TNAP en la fisiopatología hepática e intestinal. Basándonos en lo mencionado en la introducción, los objetivos concretos de la tesis doctoral son los siguientes: 1. Estudiar la implicación de la TNAP en el desarrollo de esteatosis hepática mediada por lípidos de la dieta. 2. Estudiar el papel de la TNAP epitelial intestinal en condiciones basales. 3. Estudiar el papel de la TNAP epitelial intestinal en la colitis experimental inducida por DSS. 3.MATERIAL Y MÉTODOS Para llevar a cabo los objetivos de la Tesis, se realizaron experimentos in vivo, ex vivo e in vitro utilizando una amplia variedad de técnicas o procedimientos, que incluyeron dietas modelo de esteatosis, colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS), PCR cuantitativa en tiempo real, multiplex, técnicas de histología y western blot. Se utilizaron ratones haplodeficientes para TNAP (TNAP+/-) y ratones con una deleciónn condicional del epitelio intestinal de TNAP (AlplIEC-/-) para aclarar el papel de TNAP en la esteatosis y en la integridad de la barrera intestinal. Estos últimos fueron obtenidos en nuestro laboratorio para llevar a cabo esta Tesis. 4.RESULTADOS Y DISCUSIÓN Nuestros resultados se pueden dividir en tres secciones. (1) Papel de TNAP en la enfermedad del hígado graso no alcohólico a través del modelo de dieta deficiente en metionina y colina (MCD). Animales WT y haplodeficientes fueron alimentados con una dieta control o una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) durante 17 días. Consideraciones éticas llevaron a poner fin al experimento debido a la pérdida de peso severa observada en los ratones alimentados con la dieta MCD. Los ratones alimentados con la dieta MCD mostraron signos típicos de este modelo animal, incluida la elevación de la actividad de alanina aminotransferasa (ALT) y la disminución de los niveles de glucosa en sangre, sin diferencias discernibles entre los genotipos. También se confirmó la acumulación característica de grasa hepática. Curiosamente, los ratones haplodeficientes con la dieta control mostraron microesteatosis y un mayor contenido de grasa hepática en comparación con los ratones alimentados con dieta normal (4%, p:p), implicando a TNAP en la esteatosis inducida por una dieta rica en grasas. Cabe destacar que el contenido de grasa y sacarosa en la dieta control de este experimento fue más alto que el de una dieta normal. Además, el genotipo influyó en las alteraciones en varios parámetros plasmáticos cuando los ratones fueron alimentados con la dieta control. Los ratones TNAP exhibieron niveles más altos de IL-6, péptido pancreático, resistina y glucagón en plasma. Notablemente, hubo un aumento en la expresión de genes de fibrosis (Des y Tgfb1, este último sin significación estadística) en el hígado de los ratones haplodeficientes con la dieta control, junto con niveles más altos de genes Il1b y Tnf (p=0,08). Además, la haplodeficiencia combinada con la dieta control indujo cambios en genes relacionados con el metabolismo de carbohidratos, ácidos grasos y ácidos biliares. Todos estos resultados sugieren que la TNAP puede estar involucrada en el desarrollo del fenotipo de esteatosis asociado a dietas altas en grasas. (2) Consecuencia de la eliminación de Alpl en las células epiteliales intestinales en ratones. Para determinar el papel de la TNAP en el epitelio intestinal, los ratones WT y AlplIEC-/- fueron sacrificados 7 días después de la primera inyección de tamoxifeno. Mediante el uso de cebadores Alpl_flox, se confirmó el silenciamiento del gen en las células epiteliales intestinales (IEC) colónicas y de intestino delgado. El fenotipo resultante después de la eliminación de Alpl en el epitelio intestinal fue aparentemente normal. A nivel intestinal, no se observaron diferencias histológicas. La actividad de la fosfatasa alcalina permaneció sin cambios en todos los segmentos intestinales (yeyuno, íleon, colon); sin embargo, se observaron cambios notables en la sensibilidad in vitro al levamisol y al inhibidor de TNAP. La ausencia de Alpl en las IEC indujo modificaciones en la expresión de isoformas intestinales. Específicamente, en el intestino delgado, se observó una disminución en la expresión de Akp3 y Akp6, mientras que se observó lo contrario en el colon (aunque no fue estadísticamente significativo). Estos genes codifican isoformas de IAP en el intestino de los ratones. Akp3 se expresa específicamente en el duodeno, mientras que Akp6 se expresa en niveles altos en todo el tracto gastrointestinal. Al evaluar los posibles efectos extraintestinales, se identificó una mayor actividad de AP en hueso y riñón de los ratones AlplIEC-/-, sin alteraciones en la sensibilidad a los inhibidores. La eliminación de Alpl en las IEC resultó en una regulación al alza de genes de fibrosis e inflamación en el hígado (Tgfb1, Des, Tnf). Además, se detectó un aumento en la expresión de Nt5e (vinculado al sistema purinérgico) y Tff3 (asociado al metabolismo hepático). En línea con esto, los ratones knockout mostraron niveles reducidos de colina y fosfocolina (no significativos para este último), posiblemente relacionados con una menor capacidad de desfosforilación y, por tanto, absorción de colina, resultando en un déficit de colina en el hígado. En conjunto, estos hallazgos subrayan la importancia de la TNAP intestinal no solo dentro del intestino en sí, sino también de manera sistémica. (3) Papel de Alpl epitelial intestinal en la colitis experimental. Los ratones WT y AlplIEC-/- fueron expuestos a DSS al 2.5% (p:v) durante 7 días después de inducir la eliminación del gen Alpl mediante la administración de tamoxifeno. La colitis inducida por DSS resultó en una mayor pérdida de peso en los ratones knockout y un mayor índice de actividad de la enfermedad (DAI) en las etapas tempranas de la enfermedad. No hubo diferencias entre los genotipos en longitud o grosor del colon en este modelo de colitis experimental. Histológicamente, los ratones AlplIEC-/- con colitis mostraron un aumento en la infiltración submucosa. Los resultados macroscópicos indicaron un peor estado en los ratones AlplIEC-/- durante la colitis. Sin embargo, el análisis bioquímico del colon reveló que estos ratones tenían un menor grado de inflamación, como se evidenció por la reducción de los marcadores inflamatorios. El efecto protector se hace evidente a partir de los 4 días y no está asociado a cambios en la expresión de otras isoformas de fosfatasa alcalina, sino que se atribuye al aumento temprano en la actividad enzimática dentro del colon. 5.CONCLUSIONES Las conclusiones son: 1. La haplodeficiencia del gen Alpl (ratones TNAP+/-) asociada con una dieta rica en grasa (10% p/p) induce una respuesta esteatogénica similar a la observada en animales WT alimentados con una dieta grasa deficiente en colina y metionina, con un aumento de ciertos parámetros inflamatorios y de fibrosis, y modulación de ciertos genes relacionados con el metabolismo de los ácidos biliares. Por tanto, la TNAP está implicada en la respuesta adaptativa a la grasa. 2. La deleción de Alpl en el epitelio intestinal afectó a células de intestino delgado y grueso, sin producir cambios discernibles morfológicos o moleculares en ambos segmentos, ni alteraciones sustanciales en la microbiota. La deleción indujo cambios en la expresión de ciertos genes, como Akp3, Akp6, Tjp1, Cxcl1 o Cxcl10, en células epiteliales primarias y en organoides yeyunales, si bien la naturaleza de tales cambios no fue consistente en estas poblaciones celulares, presumiblemente debido a las diferencias en el contexto biológico, como la presencia o ausencia de microbiota y células no epiteliales. 3. La deleción epitelial intestinal de Alpl altera la actividad AP extraintestinal en condiciones basales, aumentándola en hueso y riñón, sin cambios en la sensibilidad a inhibidores específicos, por lo que el patrón de glicosilación no parece verse modificado en estos tejidos. 4. La deleción epitelial intestinal de Alpl aumenta la expresión de genes relacionados con la fibrosis hepática e inflamación, y modula la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico en el hígado. Estos cambios se asocian a un déficit de colina en el hígado. Por tanto, la deficiencia de actividad TNAP en el epitelio intestinal se traduce en un menor aporte de este importante metabolito al hígado, probablemente contribuyendo al establecimiento de un fenotipo proinflamatorio y profibrótico, y presumiblemente a alteraciones en el metabolismo de lípidos. Serán necesarios experimentos a largo plazo para confirmar este extremo. 5. La deleción epitelial de Alpl da lugar a un fenotipo complejo en la colitis experimental inducida por DSS, que combina un mayor deterioro en términos macroscópicos y de infiltración neutrofílica y una expresión atenuada de marcadores inflamatorios en el colon, que parece reflejar un menor estado de activación del infiltrado mucosal. La protección se ejerce ya a los 4 días, y no está relacionada con la modulación de la expresión de otras isoformas de fosfatasa alcalina, pero sí con el incremento temprano de actividad de la enzima en el colon. 6. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral confirman que la TNAP epitelial intestinal es biológicamente relevante tanto en los tejidos intestinales como en los extraintestinales. Por lo tanto, la TNAP sigue destacando como un elemento fundamental en la función de barrera intestinal. 6. Bibliografía 1. Millán JL. Alkaline phosphatases. Purinergic Signal. 2006;2(2):335 -41. 2. Millán JL, Whyte MP. Alkaline Phosphatase and Hypophosphatasia. Calcif Tissue Int. 2016;98(4):398 -416. 3. Zimmermann H, Zebisch M, Sträter N. Cellular function and molecular structure of ecto-nucleotidases. Purinergic Signal. 2012;8(3):437 -502. 4. Poupon R. Liver alkaline phosphatase: a missing link between choleresis and biliary inflammation. Hepatology. 2015 Jun;61(6):2080 -90. 5. Sun Y, Rahbani JF, Jedrychowski MP, Riley CL, Vidoni S, Bogoslavski D, et al. Mitochondrial TNAP controls thermogenesis by hydrolysis of phosphocreatine. Nature. 2021;593(7860):580 -5. 6. Hernández-Chirlaque C, Gámez-Belmonte R, Ocón B, Martínez-Moya P, Wirtz S, de Medina FS, et al. Tissue non-specific alkaline phosphatase expression is needed for the full stimulation of T cells and T cell-dependent colitis. J Crohn¿s Colitis. 2017;11(7):857-70. 7. Marquez C, Toribio ML, Marcos MA, de la Hera A, Barcena A, Pezzi L, et al. Expression of alkaline phosphatase in murine B lymphocytes. Correlation with B cell differentiation into Ig secretion. J Immunol. 1989 May;142(9):3187-92. 8. Bessueille L, Kawtharany L, Quillard T, Goettsch C, Briolay A, Taraconat N, et al. Inhibition of alkaline phosphatase impairs dyslipidemia and protects mice from atherosclerosis. Transl Res. 2022;1-16. 9. López-Posadas R, González R, Ballester I, Martínez-Moya P, Romero-Calvo I, Suárez MD, et al. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase is activated in enterocytes by oxidative stress via changes in glycosylation. Inflamm Bowel Dis. 2011;17(2):543-56. 10. Glickman RM, Alpers DH, Drummey GD, Isselbacher KJ. Increased lymph alkaline phosphatase after fat feeding: effects of medium chain triglycerides and inhibition of protein synthesis. Biochim Biophys Acta. 1970 Feb;201(2):226-35. 11. Guthmann F, Maehl P, Preiss J, Kolleck I, Rüstow B. Ectoprotein kinase-mediated phosphorylation of FAT/CD36 regulates palmitate uptake by human platelets. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2002 Nov 1 [cited 2023 May 28];59(11):1999-2003. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12530530/ 12. Mizumori M, Ham M, Guth PH, Engel E, Kaunitz JD, Akiba Y. Intestinal alkaline phosphatase regulates protective surface microclimate pH in rat duodenum. J Physiol [Internet]. 2009 Jul 15 [cited 2023 May 28];587(Pt 14):3651-63. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19451200/ 13. Akiba Y, Mizumori M, Guth PH, Engel E, Kaunitz JD. Duodenal brush border intestinal alkaline phosphatase activity affects bicarbonate secretion in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol [Internet]. 2007 Dec [cited 2023 May 28];293(6). Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17916646/ 14. Martínez-Moya P, Ortega-González M, González R, Anzola A, Ocón B, Hernández-Chirlaque C, et al. Exogenous alkaline phosphatase treatment complements endogenous enzyme protection in colonic inflammation and reduces bacterial translocation in rats. Pharmacol Res [Internet]. 2012;66(2):144-53. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2012.04.006 15. Chen KT, Malo MS, Moss AK, Zeller S, Johnson P, Ebrahimi F, et al. Identification of specific targets for the gut mucosal defense factor intestinal alkaline phosphatase. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010 Aug;299(2):G467-75. 16. Pettengill M, Matute JD, Tresenriter M, Hibbert J, Burgner D, Richmond P, et al. Human alkaline phosphatase dephosphorylates microbial products and is elevated in preterm neonates with a history of late-onset sepsis. PLoS One. 2017;12(4):1-12. 17. Bates JM, Akerlund J, Mittge E, Guillemin K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe [Internet]. 2007 Dec 13 [cited 2023 May 28];2(6):371-82. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18078689/ 18. Wilkes JM, Garner A, Peters TJ. Studies on the localization and properties of rat duodenal HCO3--ATPase with special relation to alkaline phosphatase. Biochim Biophys Acta [Internet]. 1987 Apr 16 [cited 2023 May 28];924(1):159-66. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2950930/ 19. Moss AK, Hamarneh SR, Mohamed MMR, Ramasamy S, Yammine H, Patel P, et al. Intestinal alkaline phosphatase inhibits the proinflammatory nucleotide uridine diphosphate. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol [Internet]. 2013 [cited 2023 May 28];304(6). Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23306083/ 20. Tuyama AC, Chang CY. Non-alcoholic fatty liver disease. J Diabetes. 2012;4(3):266-80. 21. Estes C, Anstee QM, Arias-Loste MT, Bantel H, Bellentani S, Caballeria J, et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. J Hepatol [Internet]. 2018;69(4):896-904. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.05.036 22. Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, Fazel Y, Henry L, Wymer M. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 2016 Jul;64(1):73-84. 23. Dai Xin, Lv Zong-Shun, Wang Bang-Mao ZL. Expression of intestinal tight junction proteins in patients with non-alcoholic fatty liver disease - PubMed [Internet]. [cited 2023 May 11]. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24895809/ 24. Rahman K, Desai C, Iyer SS, Thorn NE, Kumar P, Liu Y, et al. Loss of Junctional Adhesion Molecule A Promotes Severe Steatohepatitis in Mice on a Diet High in Saturated Fat, Fructose, and Cholesterol. Gastroenterology [Internet]. 2016 Oct 1 [cited 2023 May 14];151(4):733-746.e12. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27342212/ 25. Luther J, Garber JJ, Khalili H, Dave M, Bale SS, Jindal R, et al. Hepatic Injury in Nonalcoholic Steatohepatitis Contributes to Altered Intestinal Permeability. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2015 Mar;1(2):222-32. 26. Miele L, Valenza V, La Torre G, Montalto M, Cammarota G, Ricci R, et al. Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2009 Jun;49(6):1877-87. 27. Alisi A, Manco M, Devito R, Piemonte F, Nobili V. Endotoxin and plasminogen activator inhibitor-1 serum levels associated with nonalcoholic steatohepatitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010 Jun;50(6):645-9. 28. Ruiz AG, Casafont F, Crespo J, Cayón A, Mayorga M, Estebanez A, et al. Lipopolysaccharide-binding protein plasma levels and liver TNF-alpha gene expression in obese patients: evidence for the potential role of endotoxin in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis. Obes Surg. 2007 Oct;17(10):1374-80. 29. Fukui H, Brauner B, Bode JC, Bode C. Plasma endotoxin concentrations in patients with alcoholic and non-alcoholic liver disease: reevaluation with an improved chromogenic assay. J Hepatol. 1991 Mar;12(2):162-9. 30. Kaplan GG, Ng SC. Understanding and Preventing the Global Increase of Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology [Internet]. 2017 Feb 1 [cited 2023 Jun 4];152(2):313-321.e2. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27793607/ 31. Sánchez De Medina F, Martínez-Augustin O, González R, Ballester I, Nieto A, Gálvez J, et al. Induction of alkaline phosphatase in the inflamed intestine: A novel pharmacological target for inflammatory bowel disease. Biochem Pharmacol. 2004;68(12):2317-26.